基于冬凌草全长转录组的TIFY基因家族鉴定与表达分析

【目的】TIFY蛋白是茉莉酸(JA)信号通路的关键调节因子,在植物生长发育、非生物胁迫以及次生代谢产物的积累中具有显著的调控作用,揭示冬凌草(Isodon rubescens)的TIFY基因可为冬凌草的抗逆性改良育种和次生代谢产物合成研究提供理论依据。【方法】基于冬凌草三代全长转录组序列,通过生物信息学方法对冬凌草TIFY基因家族进行鉴定和分析,并采用RT-qPCR技术分析其在不同组织中的表达特性。【结果】(1)成功从冬凌草中鉴定出12个TIFY家族基因成员;(2)理化性质分析表明,其氨基酸长度124~378 aa,分子量13924.89~39692.38 Da,等电点5.05~9.69;除IrTIFY10蛋白为稳定蛋白,其他均为不稳定蛋白;IrTIFYs蛋白的亚细胞定位均在细胞核,均为亲水性蛋白,且不含信号肽。(3)结构分析表明,IrTIFY家族蛋白成员无跨膜结构,二级结构中含量最多的结构类型为无规则卷曲;且含有多个磷酸化位点。(4)密码子偏好性分析结果表明,IrTIFY基因家族密码子偏好性较弱,稍倾向于使用以A或U结尾的密码子。(5)启动子元件分析表明冬凌草TIFY家族成员中存在多个光响应元件、激素响应元件和逆境响应元件等,但不同成员之间的元件存在差异。(6)进化树分析表明,冬凌草TIFY家族12个成员分为PPD(IrTIFY2)、ZML(IrTIFY3/8/10)、TIFY(IrTIFY7/12)和JAZ(IrTIFY1/4/5/6/9/11)4个亚家族,进化上与同为唇形科的丹参(Salvia miltiorrhiza)亲缘关系最近。(7)RT-qPCR分析结果显示冬凌草TIFY家族12个成员在不同组织中的表达量均表现为叶>茎>根,且大部分成员存在显著差异。【结论】TIFY基因家族在冬凌草的生长发育过程中可能发挥重要的调控作用,并且可能参与调控冬凌草次生代谢产物的合成,为进一步深入研究冬凌草TIFY基因家族的功能奠定基础和提供了思路。

冬凌草体细胞胚诱导及其组织细胞学观察

为建立冬凌草(Isodon rubescens)体细胞胚发生体系,更好地发挥在中医药学中的价值,促进资源稳定和利用,以冬凌草叶片为外植体,脱分化形成胚性愈伤组织,进一步增殖,诱导发育出体细胞胚,结合石蜡切片技术对冬凌草胚性愈伤组织及各阶段体胚进行组织细胞学观察,并探讨激素对植株再生的影响。结果表明:在B5+1.0 mg·L^(-1)2,4-D培养基中,叶片可脱分化形成淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织;在MS+1.0 mg·L^(-1)2,4-D+0.2 mg·L^(-1)6-BA培养基中,胚性愈伤组织增殖效果最好,净增殖量最大可达2.81 g;在体胚诱导中,最佳培养基为MS+1.5 mg·L^(-1) TDZ+0.2 mg·L^(-1) NAA,诱导率最高为91.33%;在MS+0.5 mg·L^(-1)6-BA+0.5 mg·L^(-1) IBA培养基中,表面含体细胞胚的胚性愈伤组织可分化出小植株;在组织细胞学观察中,胚性愈伤组织呈淡黄色或黄白色颗粒状,细胞核大且明显,其内部观察到外起源和内起源2种体胚发生方式,后期可发育为球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚或成簇状胚结构,内含淀粉粒。该研究成功建立了冬凌草间接体胚发生体系,为优化冬凌草胚性愈伤组织的“质”与“量”奠定基础,也为其分子育种及体胚技术研究提供了理论依据。

艾GRF基因家族的鉴定与表达分析

【目的】生长调节因子(growth-regulating factors,GRF)是植物的一种特有蛋白,探明艾(Artemisia argyi)GRF基因家族的生物学特性,为艾的生长发育和逆境胁迫调节提供依据。【方法】对艾GRF基因家族进行理化性质、进化、基因结构以及表达等生物信息学进行分析,进而通过转录组数据和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析基因家族各成员在不同组织、逆境胁迫以及响应不同激素的表达模式。【结果】从艾基因组中共鉴定出17个GRF家族成员,理化鉴别显示其编码蛋白均为亲水蛋白;系统发育进化树分为4个亚家族;motif分析表明进化树中同一分支的基因具有相似或相同的保守基序;AaGRF基因家族成员随机分布在11条不同的染色体上;AaGRF基因家族启动子含有多种逆境和激素响应元件;Aa GRF基因家族在响应盐碱胁迫时表现出不同的表达趋势;该家族成员在艾的根、茎、叶中的表达模式具有组织特异性;经脱落酸、吲哚乙酸、水杨酸和茉莉酸甲酯处理后,AaGRF05、AaGRF06、AaGRF11和AaGRF14在处理后的12 h基因表达量最高,表明大部分基因在前期参与不同激素的调控。【结论】艾GRF基因家族参与艾生长发育、激素与逆境胁迫调节,为探究GRF家族功能提供的理论依据。

基于UPLC特征图谱和多成分定量评价不同采收时间枸橘药材质量

目的:基于不同采收时间枸橘药材UPLC特征图谱,结合黄酮类和香豆素类成分的含量测定,明确枸橘成分积累规律,为枸橘的采收和质量控制提供依据。方法:采用UPLC法构建30批枸橘特征图谱,采用相似度评价、聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析对数据进行处理。采用HPLC法测定其中6个成分的含量。结果:30批样品UPLC特征图谱共标定25个共有峰,相似度为0.913~0.993,指认了7个成分,其中6个成分芸香柚皮苷、柚皮苷、枸橘苷、欧前胡素、异欧前胡素、葡萄内酯的含量分别为0.62~2.40 mg/g、5.75~27.52 mg/g、7.00~53.86 mg/g、0.63~2.94 mg/g、0.11~0.45 mg/g、3.69~9.29 mg/g;聚类分析可将样品分为3类,正交偏最小二乘判别分析筛选出5个质量差异标志性成分。不同采收时间枸橘药材可以通过果皮颜色区分,枸橘苷、柚皮苷、欧前胡素等是导致枸橘药材质量产生差异的主要标志物。结论:果皮颜色可作为枸橘药材的采收依据;枸橘苷、柚皮苷和欧前胡素等是枸橘药材质量差异标志物。

茜草种子质量检验方法与分级标准研究

参照《中国农作物种子检验规程》,对茜草种子的质量检验方法进行研究,以期为制定科学合理的茜草种子分级标准提供依据。种子质量测定采用百粒法,千粒重为11.6139 g;茜草种子浸种时间设为11 h;种子水分测定采用种子粉碎高温(130±2)℃处理;种子萌发时发芽床选用沙子;冷冻处理作为茜草种子的前处理,在20℃下,24 h全黑暗作为茜草种子发芽时的光照条件;采用TTC浓度0.3%,染色时间12 h,染色温度35℃,可较好测定种子的生活力,快速检测茜草种子发芽潜力。

本草中河南省道地药材的演变

通过梳理《名医别录》《本草经集注》《千金翼方》《本草图经》《本草纲目》《本草品汇精要》《本草崇原》《药物出产辨》和《增订伪药条辨》中河南省道地药材变化情况,探究其在不同历史时期本草中的发展历程。汉代至南北朝时期的《名医别录》和《本草经集注》中,道地药材产地以河南西部伏牛山区为主,南部桐柏山区及北部的太行山区有零星分布,40多种药材的主产区在今河南境内,紫草、菊花和麻黄为汉代量大质优的河南道地药材,山药、牛膝、柴胡、桔梗、知母、瓜蒌、丹参和栀子等道地药材此时已有记载;唐代《千金翼方》中道地药材产区未发生较大变化,半夏、柏子仁、茯苓、石斛、细辛和白及等为唐代形成的道地药材;北宋《本草图经》中道地药材产区向平原地区延伸,艾叶、何首乌、黄精、皂荚、五味子、薄荷和姜等为宋代形成的道地药材;明代《本草品汇精要》和《本草纲目》中道地药材分布广泛,豫中和豫东等平原地区药材数量增加,百部、藁本、远志、连翘、车前子、核桃仁、槐实、麦冬、地黄、苍术、香薷、旋覆花和重楼等为明代形成的道地药材;清代《本草崇原》和民国时期《药物出产辨》《增订伪药条辨》中道地药材种类明显减少,白术、牡丹皮、萆薢、金银花、杜仲、红花、白芷、辛夷、白附子和金钗石斛等为清代至民国时期形成的道地药材。对河南省道地药材历史与分布变迁的考证为深入理解河南省道地药材的形成提供了参考。

荔枝古树胚性愈伤组织LcCu/Zn-SOD3基因启动子的克隆及功能验证

以荔枝古树"宋荔"胚性愈伤组织为材料,采用接头染色体步移法,分离获得LcCu/Zn-SOD3启动子片段长度为1 426bp,命名为ProLcCSD3(GenBank登录号:KF672186.1)。生物信息学分析表明,该启动子含有多个逆境应答元件、激素应答元件、胚乳特异表达元件,且可能受WRKY和MYB等转录因子调控。通过双酶切方法,以ProLcCSD3替换载体pCAMBIA1301上的CaMv35S启动子,构建了重组质粒p1301-proLcCSD3-GUS,并成功转化农杆菌EHA105和GV3101。注射烟草的瞬时表达分析表明,该启动子片段可以驱动下游报告基因表达。转化拟南芥分析表明,该启动子驱动的下游GUS可以在拟南芥的根、茎、叶中表达,且可响应NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和损伤等非生物胁迫。研究表明,荔枝古树LcCu/Zn-SOD3可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号转导途径。

荔枝古树胚性愈伤组织Fe-SOD成员基因克隆及生物信息学分析

为了解Fe-SOD在荔枝古树胚性愈伤组织保存中的分子机制,选择荔枝古树"宋荔"花药诱导而来的胚性愈伤组织为试验材料,采用同源克隆和RACE方法,获得荔枝Fe-SOD的两个转录本和基因组序列,并对该基因组的内含子进行分析。克隆获得长1 285 bp含有完整开放阅读框的荔枝Fe-SOD核酸序列,其编码1个含有250个氨基酸的蛋白质,将该序列命名为LcFe-SOD7a。生物信息学分析结果表明:该蛋白为稳定的、亲水的、含跨膜结构域的偏酸性蛋白质,定位于微体(过氧化物酶体)和细胞质,具有多样的磷酸化位点。LcFe-SOD7a基因组序列长2 284 bp,含7个内含子,其中第4个内含子较长,达920 bp。同时还得到其中的1条内含子驻留型可变剪接基因,该可变剪接基因提前终止,仅编码207个氨基酸的蛋白质,将该可变剪接基因命名为LcFe-SOD7b。

不同处理对兰州百合子球根系生长的影响

为研究不同处理对兰州百合子球根系生长的影响,以兰州百合子球为试验材料,对不同处理下子球根数和根长进行了测定分析。结果表明:腐殖土/沙子(1∶1)是适宜百合子球基生根系发生的基质;栽培深度为子球高度2倍时能获得较多的基生根,栽培深度与地平齐时可获得较长的根系;NAA溶液处理能促进子球生根,合适的NAA溶液浓度在1∶1 000到1∶500之间;轻划子球鳞茎盘能够提高基生根系的发生,其处理结果极显著高于对照处理;兰州百合子球根数与根长在生长过程中都表现出快-慢-快-慢的规律。

龙眼MEE70/MSI1基因DlMEE70-1a及其可变剪接体DlMEE70-1b的分离及其在体胚发生过程中的表达分析

MEE70/MSI1是拟南芥母性效应胚胎滞育基因,在植物胚胎发生过程中具有重要作用。采用RACE技术获得龙眼MEE70-1a(登录号KC492117)及其可变剪接体MEE70-1b(登录号KC492118)c DNA序列,克隆MSI1g DNA(登录号KC492126)序列。生物信息学分析预测Dl MEE70-1a和Dl MEE70-1b均为亲水不稳定的酸性蛋白,主要定位于过氧化物酶体和细胞核,各含有4和1个WD-repeat结构域。MEE70-1a和MEE70-1b在体细胞胚胎发生过程实时荧光定量PCR分析结果表明,Dl MEE70-1a和Dl MEE70-1b表达趋势以心形胚为界,除了Dl MEE70-1b的不完全胚型紧实结构(ICp EC)到球形胚(GE)阶段之间,都表现出先降后升的趋势;胚性愈伤组织(EC)时期两者表达量一致且最高;心形胚(HE)时期,两者表达量一致且最低,另Dl MEE70-1b在不完全胚性紧实结构(ICp EC)表达量与心形胚基本一致。这2个表达剂量是胚胎发生的重要保障,心形胚(HE)后,Dl MEE70-1a被再次激活转录促进胚胎正常发育。从Dl MEE70-1a和Dl MEE70-1b的理化性质、WD重复结构域数量、亚细胞定位以及表达量和趋势,可以推测Dl MEE70-1a需要Dl MEE70-1b的协同来调控龙眼胚胎发育。

胡杨PePEX11基因参与调节盐胁迫下拟南芥的抗氧化能力

【目的】长期非生物逆境胁迫下,植物会产生过量活性氧并造成氧化损伤,过氧化物酶体能够通过清除活性氧来调节氧化还原平衡。PEX基因参与过氧化物酶体的生物发生和增殖,PEX11基因的过表达可促进过氧化物酶体增殖,对植物的抗氧化能力的提升具有重要意义。胡杨是研究木本植物中抗逆机制优良材料,本文旨在探究胡杨PEX11基因对非生物胁迫的响应。【方法】本研究首先以胡杨叶片cDNA为模板克隆获得PEX11基因,命名为PePEX11,并对PePEX11蛋白进行生物信息学分析,其次采用实时荧光定量PCR分析PePEX11在胡杨中的表达模式,同时构建植物表达pCAMBIA1301-35S::PePEX11转化拟南芥,最后检测盐胁迫条件下转PePEX11拟南芥的抗氧化能力。【结果】PePEX11基因cDNA全长543 bp,编码180个氨基酸,PePEX11蛋白具有多个跨膜结构域,在膜上发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在胡杨体的成熟叶中表达量最高,幼叶次之,茎中最少;胡杨PePEX11基因受盐胁迫上调表达。功能分析显示,在含有100 mmol/L NaCl的培养基上,转PePEX11基因拟南芥株系的根长均显著长于野生型;对盆土中的移栽后12 d的幼苗150 mmol/L NaCl盐处理2周,转基因株系表现为营养生长良好,耐盐性较强。超表达PePEX11基因能显著提高(P<0.05)拟南芥多种抗氧化酶的活性。DAB组织染色结果表明,转基因株系叶片中H_2O_2的含量明显少于野生型。【结论】本研究从胡杨中克隆PePEX11基因,并证明PePEX11能够提高拟南芥在盐胁迫下的抗氧化能力,提升耐盐能力。

胡杨bZIP转录因子PebZIP26和PebZIP33基因的克隆及功能分析

bZIP(basic region/leucine zipper motif)是一类在真核生物中分布广泛的超大转录因子家族,参与调节植物的生长发育、衰老、激素调控、能量代谢、病原防御等过程。胡杨是研究抗逆分子机制的模式木本植物,但是关于胡杨的b ZIP功能迄今未见研究报道。本研究从胡杨中克隆得到PebZIP26和PebZIP33两个转录因子的c DNA,经分析,分别编码439与371个氨基酸且PebZIP26与PebZIP33基因的表达受干旱、脱水及盐胁迫诱导。构建植物表达载体,利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥,获得Ca MV35S:PebZIP26和Ca MV35S:PebZIP33超表达株系和空载体对照株系。在含有150 mmol/L Na Cl及300 mmol/L甘露醇培养基上,PebZIP26和PebZIP33超表达株系根长均长于野生型,叶片嫩绿,无发黄萎蔫现象;另外,对盆土中的幼苗进行21 d的干旱处理和盐处理,超表达PebZIP26及PebZIP33株系耐旱耐盐性较强,表现为胁迫环境中植株营养生长较好,株高显著高于野生型(WT)及空载体对照株系,干旱复水后,植株存活率为61%及48%,显著高于WT的9%及空载体对照的12%。超表达PebZIP26及PebZIP33株系相比于WT和abf1及tga1(拟南芥同源基因ABF1及TGA1突变体)气孔关闭对外源ABA处理更加敏感,且对氧化胁迫的抗性较强。综上所述,胡杨PebZIP26和PebZIP33转录调节因子可能通过调控气孔开度和活性氧水平及根的生长正向调节植物抗旱耐盐性,进一步丰富了木本植物b ZIP的基因功能认识,为遗传育种提供基因资源及理论依据。

胡杨NAC转录因子PeNAC045基因的克隆及功能分析

NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)域蛋白是植物特有的最大的转录因子家族之一,在调节衰老,细胞分裂,木质形成,生物和非生物胁迫等方面发挥重要作用。本研究从胡杨中成功克隆出与胁迫相关的基因,并命名为PeNAC045。测序结果表明,PeNAC045基因编码区长度为915 bp,编码304个氨基酸,与毛果杨PtrNAC045的氨基酸一致性为96.05%。对PeNAC045基因在NaCl和干旱胁迫下的表达情况进行了分析,PeNAC045基因的表达受高盐和干旱的强烈诱导。利用PeNAC045的cDNA全长构建表达载体pBI121-PeNAC045-GFP,测序确认后,将重组结构和阳性对照(空载体)分别转化野生型拟南芥(Col-0),进行亚细胞定位观察,结果显示PeNAC045-GFP融合蛋白定位于细胞核上,并由DAPI进行核染色标定。利用农杆菌花序侵染法将构建的表达载体pCAMBIA1301-Pe NAC045转化野生型拟南芥和突变体(ataf2),通过PCR鉴定,获得过表达植株及ataf2/PeNAC045回补株系。对各株系进行NaCl胁迫处理,分析PeNAC045基因的生物学功能。在150 mmol/L NaCl胁迫下,相比于拟南芥突变体和野生型植株,拟南芥PeNAC045过表达株系的萌发率降低,根长变短。此外,拟南芥PeNAC045过表达株系的株高明显低于其他株系,其在苗期对盐胁迫的敏感性增加。研究结果表明,在盐胁迫下,PeNAC045作为转录调节因子,负调控胁迫相关基因的表达。

文心兰OnCOBRA基因克隆及表达模式分析

以文心兰试管苗为材料,采用RT-PCR结合RACE法,克隆文心兰OnCOBRA基因的cDNA全长和DNA序列。结果表明:COBRA全长为1 601 bp,开放阅读框(ORF)为1 386 bp,共编码461个氨基酸;OnCOBRA的DNA序列共2 949 bp,且含有6个外显子和5个内含子。生物信息学结果表明,OnCOBRA属于不稳定的疏水蛋白,具有信号肽、跨膜结构和CCVS保守区域,亚细胞定位于细胞膜中;与无油樟、玉米、籼稻、拟南芥等具有较高的同源性。系统进化树分析结果表明,文心兰OnCOBRA蛋白与玉米(ZmCOBRA)、无油樟(AtCOBRA)、籼稻(OsCOBRA)处于统一分枝,推测OnCOBRA基因是COBRA基因家族的成员。qPCR结果表明,OnCORBA为组成型表达,在成苗期表达量最高,在文心兰类原球茎时期表达量最低。

基于转录组测序分析研究山橿根乙酸乙酯部位治疗胃溃疡大鼠的作用机理

目的:初步探讨山橿缓解胃溃疡大鼠作用的分子机制。方法:将大鼠随机平均分成正常对照组、模型组、山橿根乙酸乙酯部位组,观察各组中胃溃疡的表型,并对该3组采用转录组学技术,获得各组中差异基因表达情况,并筛选出参与山橿调控胃溃疡的基因表达信号通路。结果:在山橿给药后,胃溃疡的面积明显低于模型组。高通量测序结果的GO富集分析表明胃溃疡的产生和山橿对胃溃疡的治疗过程中,涉及生物过程、细胞组分和分子功能中的多个方面,表明胃溃疡的形成与山橿对其的治疗是多组分、多基因相互作用的结果。KEGG富集结果表明,MAPK信号通路在参与胃溃疡的发生和山橿对其的治疗中起着重要的作用,其中Gadd45g基因可能作为其关键的一个靶点发挥作用。此外,胃溃疡的产生和山橿的治疗还与PI3K-αkt signaling pathway、Pathways in cancer等炎症相关信号通路有关。结论:本研究初步探讨了胃溃疡形成及山橿缓解胃溃疡大鼠的分子调控机制,为进一步解析山橿根乙酸乙酯部位治疗胃溃疡的分子机制研究奠定了良好的基础。

气雾栽培研究进展及其在药用植物中的应用前景

气雾栽培是当前多学科结合下农业领域最先进的无土栽培模式,是未来农业发展的方向。本文综述了气雾栽培技术的组成系统、优缺点和三大科学研究方向(即气雾栽培类型研究、营养液研究和自动监控技术研究),结合药用植物栽培中的问题,探讨了气雾栽培用于解决药用植物种植困境的优势。气雾栽培能够实现对药用植物的精准栽培,将有非常广阔的应用前景。

韭的本草考证

韭是中国古代治疗疾病的常用中药。为了明晰韭的应用历史,通过查阅历代本草书籍,从名称、基原、产地、入药部位、性味归经、功效和加工炮制等方面进行了梳理考证。韭在秦汉时期已有人工栽培,药用来源为韭及其同属近缘种。宋代种植广泛,主流品种为韭Allium tuberosum Rottl.ex Spreng.。宋代及之前,以韭、韭根和韭菜子等部位入药,清代韭根使用减少,现代以韭菜子入药为主。宋明时期,韭的加工炮制方法增多,性味归经和功效增加。清代多沿用历代的记载。现代河南、安徽、山东等地韭菜子产量较高。建议加强韭的活性成分及其药理作用研究。

平贝母特异性PCR鉴别方法研究

目的:建立一种客观、准确、有效的平贝母位点特异性PCR鉴别方法。方法:收集平贝母及其他贝母材料,提取样品总基因组DNA,分析比对平贝母及其他贝母ITS片段,根据差异位点设计平贝母特异性引物,采用两步法进行PCR扩增,优化反应体系并对该方法进行耐受性和适用性考察。结果:建立了平贝母的位点特异性PCR鉴别方法:引物的序列为PB-Y1F:CGGGCGGACAATTTACTT,PB-Y1R:AGATAGAGAGCGGGCGTC;反应体系:2×Taq Plus Master Mix 12.5μL,上下游引物各1μL(10μmol),DNA模板1μL,ddH_(2)O 9.5μL;扩增程序:95℃1 min;95℃10 s,57℃25 s,30个循环;72℃15 s。平贝母均能扩增出约186 bp片段,其他贝母及阴性对照无条带,方法的适用性良好。结论:该实验设计的平贝母特异性引物专属性强,所建立的特异性PCR方法可以用于平贝母药材的准确鉴别。

遥感技术在药用植物资源中的应用

近20年来,遥感技术在药用植物资源的调查、区划和动态监测中被广泛应用。随着遥感影像分辨率的提高,药用植物遥感影像解译技术水平和识别精准度也在逐步提高。由于药用植物的识别特征差异和卫星遥感技术的限制,目前遥感技术在药用植物中应用的种类偏少,应用范围较小。无人机遥感适用于分散、不规则局部区域药用植物的识别与动态监测,可以较好地补充卫星遥感技术的限制。高光谱遥感技术在药用植物中的应用处于探索阶段。建议建立卫星遥感技术和无人机遥感技术相结合的药用植物资源动态监测平台,实现药用植物资源蕴藏量的估算与预报,形成药用植物产量和品质动态监测的长期机制,促进药用植物资源的协调可持续发展。

枸橘生药学特征研究

目的研究枸橘的生药学特征。方法采用性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别进行定性鉴别,按2015年版《中国药典》附录中的方法对水分、总灰分和浸出物进行检查,HPLC检测柚皮苷、新橙皮苷含量。结果药材性状、显微鉴别特征明显;16批样品的薄层色谱斑点清晰;水分8.52%~12.12%,总灰分3.01%~5.37%,浸出物12.59%~16.84%,柚皮苷3.24%~7.60%,新橙皮苷1.28%~2.31%。结论该方法准确稳定,重复性好,可为枸橘质量标准制定提供依据。