为提升IPTR患者血小板输注后CCI值建立分级规避HLA抗体对应抗原方法及HLAMatchmaker的应用研究

目的:建立分级规避HLA抗体MFI阈值对应抗原方法,联合应用HLAMatchmaker表位计算法,选择供患者表位最小错配评分值,评估两种方法为免疫性血小板输注无效(Immune platelet transfusion refractoriness,IPTR)患者选择HLA相容性血小板供者,在提升血小板输注后校正增加值(CCI)的应用价值。方法:采用SPRCA法完成51例IPTR患者的7807次血小板交叉配型实验,判断其免疫反应阴/阳性结果。采用Luminex单抗原流式微珠法检测患者的HLA-I类抗体,获得不同特异性抗体对应HLA-I类抗原MFI值,并将其分组及分级,强阳性组(MFI>4000,1级)、中阳性组(1000中阳性组>弱阳性组)。强阳性和中阳性组与阴性对照组之间的SPRCA实验免疫反应阳性结果检出数存在统计学差异(P<0.001),弱阳性位组和阴性对照组之间的SPRCA实验免疫反应阳性结果检出数无统计学差异(P>0.05)。设置强阳性组为相应特异性HLA位点对应抗原1级规避阈值,中阳性组为2级规避阈值,弱阳性组为3级规避阈值,在供者血小板紧缺情况下,可以不需要规避弱阳性组。规避1和2级HLA-I类抗体对应供者抗原及选择HLAMatchmaker表位错配评分数≤7血小板供者策略,24 h内CCI值均>4.5×109/L,均可获得临床血小板输注有效。结论:在为IPTR患者选择HLA-I类相容性供者时,分级规避HLA-I类抗体对应供者抗原,综合选择供受者HLAMatchmaker表位错配评分数≤7,经血小板交叉配型实验确认为阴性结果的供者选择策略,对提升IPTR患者血小板计数具有一定实际应用价值。

国产粒细胞集落刺激因子动员健康供者造血干细胞的临床观察

目的:观察国产粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对32名健康供者外周血造血干细胞动员效果及不良反应。方法:选取2017年4-11月期间32名健康供者应用G-CSF 5~10μg/(kg·d)连续5 d皮下注射,若第4天白细胞低于30×10~9/L,第4.5天开始采集前2 h加用G-CSF 5μg/kg皮下注射,用COBE Spectra血细胞分离机采集外周血造血干细胞,若采集数量不够,第5.5天再采集1次。观察供者动员前后血常规的变化和采集造血干细胞结果,以及出现的不良反应。结果:动员后第4.5天白细胞明显高于动员前,差异均有统计学意义(P<0.05)。32名供者均成功采集,外周血单个核细胞(PBMNC)8.5(3.17~20.95)×10~8/kg、CD34^+6.43(2.15~17.5)×10~6/kg,其中4名供者需采集2次,余28名供者均采集1次。10名供者出现腰背部酸痛,3名出现乏力,均能耐受;4名供者采集过程中出现口唇、四肢麻木,予静滴钙剂后均缓解。结论:所有供者经G-CSF动员后均可成功采集,并能耐受其不良反应,可替代进口G-CSF供临床使用。

赛格力与惠尔血动员健康供者造血干细胞效果的比较

目的:回顾性比较国产粒细胞集落刺激因子(G–CSF)赛格力与进口G–CSF惠尔血对健康供者外周血造血干细胞的动员效果。方法:供者应用赛格力或惠尔血4.2~12.8μg·kg^(-1)·d^(-1)连续5 d皮下注射,若第4天白细胞低于30×10~9·L^(-1),第4.5天开始采集前2 h加用G–CSF 5μg·kg^(-1)皮下注射,用COBE Spectra血细胞分离机采集外周血造血干细胞,若采集数量不够,第5.5天再采集1次。并观察供者动员、采集时出现的不良反应。结果:赛格力组与惠尔血组所用剂量,分别为(7.6±1.6)μg·kg^(-1)·d^(-1),(5.4±0.7)μg·kg^(-1)·d^(-1),组间比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。赛格力组与惠尔血组动员后白细胞均升高,分别为(43.3±11.1)×10~9·L^(-1),(45.1±7.5)×10~9·L^(-1),组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。赛格力与惠尔血对供者外周血造血干细胞的影响,赛格力组有2例供者需采集2次,两组结果分别为采集物单个核细胞(MNC)·kg^(-1)(9.3±4.4)×10~8·kg^(-1),MNC·kg^(-1)(8.9±6.2)×10~8·kg^(-1);CD34^+·kg^(-1)(6.9±5.3)×10~6·kg^(-1),CD34^+·kg^(-1)(8.3±7.3)×10~6·kg^(-1),组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。两种动员剂对供者不良反应无显著差异。结论:赛格力动员效果略差于惠尔血,但通过增加赛格力剂量、采集干细胞次数,两者均能成功的动员健康供者。赛格力能可靠用于健康供者的动员。

磁力搅拌悬浮培养大规模扩增脐血造血祖细胞

为了利用磁力搅拌悬浮培养装置大规模体外扩增脐血造血祖细胞,从脐血分离单个核细胞,以无血清培养基stem span添加干细胞因子、FLT-3配基及血小板生成素为培养体系进行培养。先研究磁场(25和50mT)对静态扩增培养的造血祖细胞生长和集落形成能力的影响,再研究磁力搅拌悬浮大规模培养对造血细胞总数扩增、造血集落形成和表面分子标志表达变化。结果表明,在0,25和50mT磁场组和磁转子组,细胞总数扩增倍数和造血集落形成数在各组间均无明显区别(p>0.05)。经过7天的扩增培养,磁力搅拌悬浮大规模培养细胞总数扩增倍数为2.8±0.45,高于静态培养细胞总数扩增倍数(2.1±0.48)(p<0.01);磁力搅拌悬浮培养组形成的红系集落数(1983.5±582.6)、粒-巨噬细胞集落数(186.4±62.7)明显高于静态培养形成的相应的造血集落数(分别为1396.2±425.7和136.5±40.8)(p均<0.05)。磁力搅拌悬浮扩增后造血干细胞(CD34+、CD34+/CD38-或CD133+)比例分别为(0.9±0.34)%、(0.7±0.21)%和(1.1±0.35)%,低于静态培养的干细胞比例[分别为(1.4±0.35)%、(1.2±0.34)%和(1.6±0.68%)](p均<0.05);但是,归巢相关分子CD184和CD62L高于静态扩增培养。结论:磁力搅拌悬浮装置可能有利于脐血造血祖细胞规模扩增,本研究结果还有待于动物实验及临床移植试验进一步验证。

肥大细胞瘤小鼠异基因造血干细胞移植的急性移植物抗宿主病动物模型的建立和评价

目的:初步探索应用环磷酰胺预处理建立异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的急性移植物抗宿主病(a GVHD)动物模型的可行性。方法:以C57/BL/6鼠(B6鼠)为供鼠,B6D2F1鼠(F1鼠)为受鼠,将F1鼠随机分为a GVHD组(Ⅰ组)、肿瘤组(Ⅱ组)和空白组(Ⅲ组),Ⅰ、Ⅱ组均于allo-HSCT予环磷酰胺300 mg/m2·d-1,d-5^-3腹腔注射,Ⅲ组则予等体积的生理盐水腹腔注射;预处理后,Ⅰ组F1鼠经尾静脉注射肥大细胞瘤P185细胞(白血病细胞)、B6鼠的骨髓、脾脏细胞三者的混合液,Ⅱ组小鼠注射肥大细胞瘤P185细胞,Ⅲ组注射等体积的RPMI-1640培养基,随后观察各组小鼠的一般情况及a GVHD发病情况。结果:环磷酰胺预处理后,Ⅰ组小鼠均出现a GVHD,其中4只死于a GVHD,8只存活且a GVHD临床评分1~6分,小鼠出现皮肤受损、耸毛等表现,病理表现为大量的淋巴细胞浸润;Ⅱ组小鼠于第18天内全部死亡,出现后肢的麻痹等表现,病理表现为大量的肿瘤细胞浸润肝脏;Ⅲ组小鼠全程活泼好动,无异常。结论:肥大细胞瘤小鼠allo-HSCT应用环磷酰胺预处理,建立a GVHD动物模型是可行的,且操作简单,对人、动物和环境的危害较小。

急性髓系白血病患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族表达及克隆性增殖分析

本研究探讨AML患者在初发、治疗缓解后、复发等不同疾病状态下外周血T细胞TCRVβ亚家族表达及T细胞克隆性增殖的情况,分析不同白血病细胞负荷对患者外周血T淋巴细胞数量及功能,尤其是对抗白血病功能的影响。应用RT-PCR扩增11例AML白血病患者不同疾病状态下及3名正常供者外周血的TCRBV24个家族的基因序列,通过基因扫描(genescan)的方法判断TCRBV家族的克隆表达、CDR3克隆性质,比较不同疾病状态下白血病患者外周血T细胞的Vβ亚家族的应用、克隆性增殖、T细胞的复杂性以及T细胞免疫表型的变化。结果表明:11例AML白血病患者初诊时外周血T细胞均表达部分TCRVβ亚家族,经体外诱导后TCRVβ亚家族表达增加;完全缓解期患者外周血T细胞TCRVβ亚家族数量明显增多,但未达到完全正常;4例患者在复发时TCRVβ亚家族表达数量明显下降;11例患者中有9例在初诊时外周血有1至2个TCRVβ亚家族T细胞克隆性增殖,缓解期克隆性增殖的Vβ亚家族T细胞有增加趋势,在多数病例观察到部分Vβ亚家族T细胞在初发、缓解、体外诱导扩增以及复发时仍维持克隆性增殖状态;AML白血病患者初发及复发时T细胞CDR3复杂性明显降低,呈偏态分布,而疾病缓解时T细胞复杂性有所改善。结论:AML白血病患者外周血T细胞TCRVβ亚家族呈限制性表达;在大多数病例中无论是疾病初发抑或缓解及体外诱导、甚至在疾病复发时均可观察到克隆性T细胞的存在;在部分病例中某些Vβ亚家族在上述不同疾病状态下始终维持克隆性增殖状态,部分Vβ亚家族的克隆性增殖同白血病细胞的存在相关;在疾病状态下,AML白血病患者外周血T细胞的复杂性有所降低,而疾病缓解后可部分恢复。

高增殖潜能内皮祖细胞促进脐血造血祖细胞体外扩增

目的:研究脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞支持脐血造血干/祖细胞体外扩增的能力。方法:利用第3代的HPP-EPC联合细胞因子培养脐血造血干/祖细胞,分因子组、非接触培养组和接触培养组。体外培养脐血CD34^+细胞10 d后,从细胞总数,CD34^+细胞数,各系造血集落形成细胞数等比较各组的扩增效率。结果:接触组细胞总数扩增倍数(44.6±8.7)倍和非接触组(39.5±7.3)倍均高于因子组(24.8±5.6)倍,P<0.01。接触组CD34^+细胞数扩增倍数(8.8±2.1)倍高于因子组(2.9±0.6)倍和非接触培养组(3.3±0.6)倍,P<0.01。接触组集落扩增倍数和非接触组均分别高于因子组,P<0.05,且接触组各造血集落扩增数均分别高于非接触组,各P<0.05。接触组扩增后CD34^+CD38^-细胞(10.8%±2.7%)明显高于因子组(4.1%±0.9%)和非接触培养组(3.8%±0.8%),P<0.01。结论:脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞能支持脐血CD34^+细胞体外扩增。

急性移植物抗宿主病患者血浆miR-155的表达及其临床意义

目的:探讨急性移植物抗宿主病(aGVHD)患者miR-155的表达水平及其临床意义。方法:采用造血干细胞移植患者移植第0、第7、第14、第21及第28天的血浆标本,实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测miR-155相对表达量,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测患者血浆中白细胞介素(IL)-4、IL-7、IL-10的含量。结果:miR-155在移植后第7天开始逐渐升高,到第28天时升高明显,患者移植后不同时间点miR-155相对表达量比较差异具有统计学意义(P<0.05)。allo-HSCT后不同时间点IL-4、IL-7、IL-10水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:allo-HSCT后miR-155较IL-4、IL-7、IL-10水平变化出现早,可作为早期诊断和预测a GVHD的无创性生物标记物。

异基因造血干细胞移植后MHC单倍体相合脾脏抗白血病疗效分析

目的:观察主要组织相容性复合体(MHC)单倍体相合脾脏对非清髓异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)抗白血病疗效的分析。方法:用8~12周C57/BL/6近交系小鼠(B6鼠)作为供鼠,取其骨髓细胞和脾细胞;P815细胞即白血病细胞,近交系DBA/2小鼠与近交系C57/BL/6小鼠杂交的第一代小鼠B6D2F1(F1鼠)为受鼠,受鼠骨髓移植d-5~d-3,用环磷酰胺300mg/(m^2·d)腹腔注射预处理,受鼠移植当天(d0),将F1鼠随机分为A、B、C、D 4组,每组12只,其中A组经尾静脉注射P815细胞(1×10~4个)、骨髓细胞(5×10~6个)和脾细胞(2×10~7个)的混合细胞悬液,B组经尾静脉注射P815细胞(1×10~4个)和骨髓细胞(5×10~6个)的混合细胞悬液,C组经尾静脉注射P815细胞(1×10~4个)的细胞悬液,D组经尾静脉注射RPMI 1640细胞培养基。比较4组小鼠血象、急性移植物抗宿主病(GVHD)评分以及皮肤、肝、结肠的病理白血病细胞浸润情况。结果:(1)移植后第14天,A组GVHD评分2~4分,第15天3只小鼠死亡,第26天2只小鼠GVHD评分6分,其它7只小鼠GVHD评分0~3分,第28天死亡1只,存活的8只小鼠GVHD临床评分1~6分。B组小鼠第6天开始出现死亡,至第17天死亡11只,第30天时仅存活1只。C组第18天时全部死亡。(2)4组小鼠移植后第7天时,A、B、C组小鼠白细胞数量明显增高,组间比较有明显差异(P<0.05),与D组比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。移植后第14天时,4组小鼠白细胞数均明显下降,A组分别与B、C、D组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)移植后第28天,A、D组白细胞数均回升,组间比较无明显差异(P>0.05)。A组小鼠的肝脏可见炎性细胞浸润,汇管区肝细胞萎缩、坏死,中央静脉区少量白血病细胞浸润。B组可见肝细胞数量减少,肝窦内白血病细胞弥散性浸润。结论:非清髓allo-HSCT MHC单倍体相合脾脏可以提高抗白血病的疗效。

培门冬酶对成人急性淋巴细胞白血病患者凝血功能的影响及处理方法

目的探讨培门冬酶对成人急性淋巴细胞白血病患者凝血功能的影响及处理方法。方法应用培门冬酶方案对33例急性淋巴细胞白血病患者进行化疗，在培门冬酶治疗前ld及治疗后4、9、14d，进行血浆凝血酶原时间（胛）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血浆纤维蛋白原（FIB）监测，并对纤维蛋白低于1．0g/L的患者输注适量的冷沉淀。结果33例患者经培门冬酶治疗后，31例患者出现凝血功能异常（占93．9％），以FIB下降为主：除治疗后4dPT与治疗前比较差异未见统计学意义（P〉0．05），治疗后PT、AFTT、FIB与治疗前比较差异有统计学意义（P〈0．05）。经输注适量冷沉淀治疗后，2例患者出现皮肤散在瘀斑，其余患者未见明显出血现象。治疗后2周FIB逐渐恢复，但仍未达正常，与治疗前比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论应用培门冬酶时需密切定期监测患者凝血功能变化，培门冬酶对FIB影响明显，必要时补充冷沉淀治疗。

人脐血造血干／祖细胞的生物反应器大规模扩增及移植实验

目的利用生物反应器大规模扩增人脐血造血干／祖细胞，并通过动物移植实验检验该方法的有效性。方法采集抗凝脐血10份，分离出单个核细胞（MNC），分别进行生物反应器扩增培养和静态扩增培养。检测扩增前后细胞表面CD34、CD38、CD133、CD184和CD62L分子的表达，并进行造血干／祖细胞集落的培养。取非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠，以X射线照射后，分为4组，其中MNC组小鼠注射未经扩增培养的MNC；静态扩增组小鼠注射经过静态扩增培养的细胞；反应器扩增组小鼠注射经过生物反应器扩增培养的细胞；空白对照组小鼠注射生理盐水。移植后6周处死存活小鼠，收集骨髓细胞，检测其中CD45^＋、CD3^＋、CD19^＋和CD33^＋细胞的含量以及人特异的Cart—I和Alu基因的表达。结果生物反应器扩增前MNC为（1．2～2．8）×10^8个，扩增后为（3．7～12．6）×10^8个，扩增后的细胞数明显高于静态扩增培养者（P〈（0.01）。经生物反应器扩增后所形成的红系集落形成单位、粒一巨噬细胞集落形成单位数明显高于经静态扩增者（P〈0．05）。移植6周后，空白对照组小鼠均死亡，MNC组存活率为35％，静态扩增组存活率为30％，反应器扩增组存活率为62．9％，后者明显高于前二者（P〈0．05）。各组存活小鼠骨髓细胞中均检测到Alu基因和Cart—I基因的表达以及人源CD33^＋、CD45^＋、CD3^＋及CD19^＋细胞。结论利用生物反应器可大规模扩增人脐血造血干／祖细胞，所得细胞能植入小鼠体内，并能获得造血功能重建。

人脐血造血干／祖细胞的磁力搅拌悬浮培养及移植实验

目的探讨磁搅拌大规模培养体系对人脐血造血祖细胞的扩增效果以及扩增的人造血祖细胞植入动物体内后的造血重建情况。方法从新鲜抗凝脐血中分离出单个核细胞（MNC），以添加干细胞因子、酪氨酸激酶受体3配基及血小板生成素的无血清培养体系进行培养。静态扩增组的细胞置于T25培养瓶中培养，磁搅拌悬浮扩增组（磁搅拌扩增组）的细胞采用Celstir装置进行培养，培养体系为50～100ml。培养7d后进行细胞计数、集落培养检测和细胞表面分子表达的测定。以不进行培养者为对照组。非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠在接受2．5Gy的亚致死剂量X射线照射后分别从尾静脉输入上述静态扩增组、磁搅拌扩增组和对照组的MNC（5×10^6个），另设不移植的空白对照组。观察小鼠的存活情况，6周后处死存活小鼠，检测骨髓细胞中CD34^＋细胞、CD3^＋细胞、CD19^＋细胞、CD33^＋细胞及CD45^＋细胞的含量以及人特异的Cart—I和Alu基因的表达。结果经过7天的培养，磁搅拌扩增组的造血祖细胞扩增倍数为（2．8±0．45）倍，明显高于静态扩增组的（2．1±0．48）倍（P〈0．01）。磁搅拌扩增组形成的红系集落、粒-巨噬细胞集落数均明显高于静态扩增组（P〈0．05）。静态扩增组扩增后的CD34^＋细胞、CD34^＋CD38^-细胞和CD133^＋细胞含量均高于磁搅拌扩增组（P〈0．05），而CD184^＋细胞和CD62L^＋细胞含量低于磁搅拌扩增组（P〈0．01）。移植后6周，对照组、静态扩增组和磁搅拌扩增组分别有3、4、5只小鼠存活，三组间两两比较，6周存活率的差异无统计学意义（P〉0．05）。存活6周的小鼠，其骨髓中能检出人特异性CD34^＋细胞，以及CD3^＋细胞、CD19^＋细胞、CD33^＋细胞及CD45^＋细胞，也检测到人Alu基因和Cart—I基因的表达。结论磁搅拌培养能大规模扩增脐带血造血祖细胞，扩增的细胞能植入X射线照射的NOD／SCID小鼠，并重建其多系造血。

脂质体多柔比星强化预处理方案异基因造血干细胞移植治疗白血病的效果观察

目的探讨脂质体多柔比星强化预处理方案异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗白血病的效果。方法回顾性分析深圳市第二人民医院2016年1月至2017年6月20例应用脂质体多柔比星强化预处理方案allo-HSCT患者的资料。分析患者移植效果、并发症发生情况及预后。结果白细胞植活中位时间17 d(13~23 d),血小板植活中位时间22.5 d(最短13 d,最长>90 d)。急性移植物抗宿主病(GVHD)和慢性GVHD分别有2例和1例;出血性膀胱炎8例,EB病毒血症15例,巨细胞病毒血症8例,败血症1例,急性肝损伤1例,真菌性肺炎2例。中位随访31.7个月(0.8~53.8个月),1例患者移植后第25天发生颅内感染而死亡;3例患者随访期内复发,其中2例死亡;其余16例患者随访期复查均为100%供者基因。结论脂质体多柔比星强化预处理方案allo-HSCT治疗白血病效果较好,提高预处理强度未增加治疗相关不良反应。EB病毒、巨细胞病毒血症发生率虽然较高,但积极治疗后均好转。

血液透析滤过处理CAR-T治疗后IL-6受体抑制剂治疗无效的3~4级细胞因子释放综合征3例

目的观察血液透析滤过(HDF)处理嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)免疫疗法后IL-6受体抑制剂治疗无效细胞因子释放综合征(CRS)的有效性及安全性.方法回顾性分析2015年7月至2021年7月深圳大学第一附属医院血液内科经CAR-T细胞治疗后出现托珠单抗治疗无效的3~4级CRS并接受HDF治疗的3例患者,包括急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)2例,弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)1例.结果患者在HDF治疗结束后12h内临床症状(体温、血压、血氧)缓解,细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ及C反应蛋白(CRP)明显下降.随访3个月未发现HDF治疗相关不良反应.结论HDF控制CAR-T细胞治疗后托珠单抗治疗无效3~4级CRS安全可行.

蛋白酶体抑制剂同类药物转换对初治多发性骨髓瘤患者疗效和预后的影响

目的探讨蛋白酶体抑制剂(PI)硼替佐米同类药物转换为伊沙佐米治疗初治多发性骨髓瘤(MM)患者的有效性和安全性。方法回顾性分析2018年1月至2020年12月深圳市第二人民医院收治的63例初治MM患者临床资料,分为转换组(23例)和硼替佐米组(40例),两组均以含硼替佐米的方案为一线治疗方案,转换组患者因不耐受硼替佐米不良反应转换为伊沙佐米,硼替佐米组患者未进行药物转换。比较两组患者疗效及无进展生存(PFS)的差异。结果转换组患者进行同类药物转换前总有效率(ORR)为95.7%(22/23),≥非常好的部分缓解(VGPR)率为52.2%(12/23);转换后ORR为95.7%(22/23),≥VGPR率为82.6%(19/23);硼替佐米组ORR为90.0%(36/40),≥VGPR率为72.5%(29/40),两组患者ORR及≥VGPR率比较差异均无统计学意义(χ^(2)=0.64,P=0.424;χ^(2)=0.82,P=0.364)。转换组接受PI治疗的中位周期数为9个,中位PFS时间未达到;硼替佐米组接受PI治疗的中位周期数为7.5个,中位PFS时间为30.0个月(95%CI 19.1~40.9个月),两组PFS差异无统计学意义(P=0.275)。硼替佐米组中,12例因不良反应停用硼替佐米,其中位PFS时间20.0个月(95%CI 12.6~27.4个月),转换组与硼替佐米组停用PI患者的PFS比较,差异有统计学意义(P=0.043)。转换组患者发生周围神经病变21例(21/23,91.3%),≥3级不良反应的发生率为13.0%(3/23);硼替佐米组发生周围神经病变22例(22/40,55.0%),≥3级不良反应的发生率为12.5%(5/40)。结论对于初治MM患者,硼替佐米转换为伊沙佐米能提高缓解深度,减少因停用PI导致的复发。