G型产气荚膜梭菌的分离鉴定及黄羽肉鸡发病模型的建立

为筛选鸡源G型产气荚膜梭菌(Cp)强毒菌株并建立黄羽肉鸡坏死性肠炎(NE)的发病模型,本研究从国内不同地区采集292份鸡肠道及粪便样品,其中健康鸡样品154份,疑似患NE鸡样品138份,经TSC-卵黄平板分离及16S rRNA基因的PCR扩增及测序鉴定,采用多重PCR扩增分离Cp的毒素基因(α、β、ε、ι毒素、肠毒素和坏死性肠炎毒素B(NetB),以确定分离株的毒素分型。结果显示,共获得86株Cp,其中3株从健康鸡样品中获得,83株从患病鸡样品中获得。毒素分型的PCR结果显示,分别出现约900 bp(α毒素)、550 bp(β毒素)、738 bp(NetB毒素)的目的条带;未扩增到ε毒素、ι毒素及肠毒素(506 bp);经统计后结果显示,18株Cp为A型(20.39%),12株为C型(13.95%),56株为G型(65.12%)。选择其中10株生长较好的G型Cp,通过腹腔注射0.2 mL(1×10^(9)cfu/mL)感染小鼠以评估其致病性,结果显示G型Cp分离株CpZZ2、CpDYC1和CpZD1的致病性均较强。将一日龄黄羽肉鸡分成8组,1组~6组为实验组,7组为球虫对照,8组为阴性对照,相应组别黄羽肉鸡于10日龄时经口灌服感染巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)孢子化卵囊,13日龄更换为高蛋白饲料,14日龄分别经口灌服感染G型Cp CpZZ2和CpDYC1株,其中两组鸡连续3 d感染上述两株G型Cp,以构建鸡NE发病模型。在17 d的观察期内统计各组肉鸡的存活率、相对增重率。同时剖杀所有鸡,根据肠道病变评分标准评价各组鸡的肠道病变,筛选致鸡NE的最佳组合。结果显示,通过上述标准判定使用巨型艾美耳球虫(1×10^(9)个孢子化卵囊)+高蛋白饲料(蛋白含量35%)+梭菌(CpZZ2)组的鸡急性NE发病模型成功构建,该组鸡因NE引起的死亡率可达50%,剖检后该组鸡肠道出现充气增粗、肠道内容物为红褐色豆腐渣样物等NE典型病变,而高蛋白饲料+Cp(CpZZ2)组及连续感染Cp组鸡虽不致死鸡,但该两组鸡小肠肠道也出现NE相关病变,可能为亚临床感染,其余各组鸡均无死亡和明显临床症状。本研究从临床分离并筛选的G型Cp强毒菌株,联合球虫感染和高蛋白饲料,诱发了黄羽肉鸡的NE,建立了黄羽肉鸡NE的发病模型,为进一步研究我国黄羽肉鸡NE的发病机制及疫苗研发奠定了基础。

我国部分地区黄羽肉鸡布氏艾美耳球虫感染情况调查

为了解我国黄羽肉鸡布氏艾美耳球虫感染情况,研究从16个省份的规模化黄羽肉鸡场收集不同日龄鸡粪便样品共696份,使用基于鸡球虫序列特征扩增区(SCAR)标记筛选基因的布氏艾美耳球虫特异性引物及探针,采用荧光定量PCR进行检测和鉴定。结果显示,布氏艾美耳球虫的总感染率为34.20%,16个省(市、区)养鸡场均存在布氏艾美耳球虫感染,且不同地区感染率差异显著(P<0.05)。不同日龄鸡群布氏艾美耳球虫的感染率差异不显著(P>0.05),40日龄以上鸡群感染率相对较高;双层平养模式鸡群感染率明显高于单层平养的鸡群。研究结果提示,目前我国各地区黄羽肉鸡布氏艾美耳球虫感染率较高,不同地区间总体感染率差异显著,不同日龄黄羽肉鸡群的感染率差异不显著,应在养殖过程中全程防控,且对双层平养鸡群进一步加强防控措施。

猪等孢球虫顶膜抗原蛋白AMA1的生物信息学分析及原核表达

[目的]预测分析猪等孢球虫顶膜抗原蛋白AMA1的生物学特性、结构及功能,并构建AMA1基因的原核表达载体,表达、纯化AMA1蛋白。[方法]本研究从NCBI数据库中获得猪等孢球虫AMA1基因序列,使用相关生物信息学预测工具对AMA1基因编码的蛋白进行分析。构建原核表达载体pET23a-AMA1,并将其转入至大肠埃希菌表达菌株BL21 (DE3)中,对诱导时间、温度及IPTG浓度进行优化,确定最佳诱导表达条件。采用镍柱亲和层析法进行蛋白纯化,获得AMA1重组蛋白并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定分析。[结果]生物信息学预测显示,AMA1蛋白由317个氨基酸组成,蛋白分子式为C1 512H2 310N394O490S14,是不稳定的亲水性蛋白;其二级结构α螺旋占17.74%,β折叠占30.65%,转角占30.65%,无规则卷曲占20.96%;属于无信号肽的跨膜蛋白,具有5个B细胞抗原表位。成功构建pET23a-AMA1重组表达质粒,经诱导表达条件优化后,确定最佳诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG浓度下于28℃诱导12 h,主要以可溶性蛋白形式存在,蛋白相对分子质量约为25 800,纯化蛋白质量浓度为0.25 mg/mL。[结论]阐明了猪等孢球虫AMA1蛋白的结构特征,通过原核诱导表达获得了重组蛋白,为建立猪等孢球虫病的免疫学诊断方法奠定了基础,并为后续疫苗的研发提供了新的候选基因。

1日龄雏鸡喷淋免疫球虫病疫苗与未免疫鸡群混养后的群体免疫效果研究

为研究球虫病疫苗喷淋免疫接种1日龄雏鸡的免疫效果以及混入少量未免疫鸡后的群体免疫效果,试验采用喷淋免疫方式对1日龄麻黄鸡进行鸡球虫病四价活疫苗免疫接种(喷淋免疫组),混入10%的未免疫鸡(混养免疫组)标记后与喷淋免疫组进行地面平养混养,并设不免疫不攻虫的空白对照组和不免疫仅攻虫的阳性对照组。喷淋免疫组、混养免疫组经垫料中球虫生活史循环的自然首免、二免、三免后和阳性对照组于32日龄时分别进行混合强毒虫株53万/只(含堆型13万、柔嫩17万、巨型23万)和毒害强毒虫株12万/只攻虫。检测各组免疫后的卵囊产量、卵囊检出率和疫苗反应以及攻虫后的增重和肠道病变计分情况。结果显示,喷淋免疫组免疫后第6~8天的卵囊检出率为80%~95%;经自然二免循环后,喷淋免疫组和混养免疫组的卵囊检出率均达到100%,排卵高峰期和卵囊产量趋于同步,喷淋免疫组平均肠道病变记分在0~0.1。攻虫后,喷淋免疫组(攻混合强毒虫株的为85.8%、攻毒害强毒虫株的为99.5%)和混养免疫组(99.9%、101.7%)的相对增重率远高于阳性对照组(9.6%、32.2%)。喷淋免疫组混合强毒株攻虫后十二指肠、盲肠及毒害强毒株攻虫后的小肠中段肠道病变记分显著低于阳性对照组(P<0.05)。以上结果表明,1日龄雏鸡喷淋接种球虫疫苗可建立良好的免疫保护,掺入10%未免疫的鸡也能通过自然循环建立足够的免疫保护力。

环丙氨嗪和甲基吡啶磷在猪场联合灭蝇的效果评估

为了探索猪场灭蝇的有效手段,完善猪场生物安全体系,本试验选取某规模化猪场8栋猪舍,饲喂环丙氨嗪以控制粪便中家蝇幼虫孳生,在猪舍内喷雾和撒布甲基吡啶磷以杀灭成蝇。分析和比较用药前、后家蝇幼虫的发育情况和死亡率,以及家蝇成虫的密度,以评估2种药物在猪场联合使用的灭蝇效果。结果显示,给猪饲喂环丙氨嗪前(第1、4天)所采集粪便中的家蝇幼虫发育过程完整,死亡率较低,分别为32.7%和12.3%,用药后(第7、10、13、16、19、21天),所采集粪便中的幼虫发育停滞,死亡率均达100%;甲基吡啶磷喷雾用药5 d后,家蝇平均密度为1.88只/(张·时),与不用药对照[平均密度2.72只/(张·时)]相比下降了30.98%;改用撒药5 d后,家蝇平均密度为0.11只/(张·时),与喷雾用药相比下降了94.12%。结果表明,环丙氨嗪和甲基吡啶磷联合使用的灭蝇方案起到良好的效果。

弓形虫ITS及5.8S序列的PCR扩增、克隆及分析

通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株,以及国际标准强毒株RH株的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5 8SDNA序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析,旨在对国内不同宿主间弓形虫虫株的遗传变异情况进行分析和验证,为分子遗传学和分子诊断学研究提供资料。结果显示:QH绵羊株、ZS人株、SH人株、CN猪株的ITS及5 8S序列完全一致,且与GenBank上注册RH株的ITS及5 8S序列也一致;仅实验室传代保存的RH株的ITS2序列与其它4株的ITS2有2个碱基的差异。结果表明ITS可作为分子标记用于弓形虫与其它原虫的种间鉴定,但不适合用于弓形虫种内遗传变异的研究。

广东集约化猪场结肠小袋纤毛虫感染情况调查

为了解广东省集约化猪场的结肠小袋纤毛虫的感染情况,我们于2001年7月至2003年12月,采用粪便检查法抽检了广东省20个代表性集约化猪场的种猪和肉猪共1906头的粪样。结果发现,场阳性率为100%,各场的感染率为14.2%～72.2%。其中种母猪的感染率为46.8%,种公猪的感染率为50.5%,育肥猪的感染率为49.8%,生长猪的感染率为34.8%,保育猪的感染率为20.1%。本文的调查结果表明,广东省集约化猪场不同生长阶段猪结肠小袋纤毛虫的感染情况均很严重,调查结果为猪场制定防制结肠小袋纤毛虫的措施提供了科学依据。

集约化猪场常用驱虫方案及其驱虫效果探讨

对集约化猪场不定期驱虫、一年两次驱虫、阶段性驱虫和“四加一”驱虫方案的效果及效益进行了大规模调查评估。

猪场传播非洲猪瘟媒介节肢动物及其防控

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种临床上以高热、皮肤充血,淋巴结、脾脏、肾脏等内脏器官出血,病程短,病死率高达100%为主要特征的非人畜共患的烈性传染性疾病。ASFV可感染家猪、野猪和软蜱,是唯一一种以节肢动物为生物媒介的DNA病毒。由于该病毒对养猪行业危害甚大,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。

中国4个弓形虫虫株GRA6基因的比较分析

通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株,以及国际标准强毒株RH株的致密颗粒抗原(GRA6)基因进行PCR-RFLP分析,首次对中国弓形虫虫株进行了基因分型研究,旨在了解中国弓形虫基因型的分布情况,从而为进一步的分子遗传学研究以及弓形虫病的防制提供资料。PCR-RFLP分析显示两种带型:RH、SH、CN3株弓形虫为一种带型,QH和ZS2株弓形虫为另一种电泳带型。GRA6序列分析结果显示:RH、SH、CN3株弓形虫的GRA6基因序列上的MseΙ酶切位点与国外报道的RH株一致,同属于基因型Ι,为强毒株;QH和ZS2株弓形虫的MseΙ酶切位点与国外报道的弱毒株BEVERLEY株和ME49株一致,同属于基因型Ⅱ,与PCR-RFLP分析结果一致。除MseΙ酶切位点外,中国的几个虫株GRA6序列与GenBankTM注册的RH株及BEVERLEY和ME49两个弱毒株有个别碱基的差异。结果证明中国人源弓形虫包含了Ι、Ⅱ两种基因型,而动物源性弓形虫则因宿主和来源地不同亦有Ι、Ⅱ两个基因型。

鸡球虫病四价活疫苗免疫保护效果试验

长期以来，本病的防治一直依赖药物，但是随着药物的广泛使用，球虫抗药性问题日趋普遍和严重，用于防治鸡球虫病的药物选用范围越来越窄，因此，免疫将成为预防球虫病的主流。为了进一步检验鸡球虫病四价活疫苗的免疫保护效果，同时观察该疫苗对鸡增重和饮食的影响，为其在生产中的推广应用提供依据，特进行以下试验。

有齿食道口线虫ITS及5.8S DNA片段的PCR扩增、克隆及序列分析

运用 PCR 方法以保守引物 NC5 及 NC2 扩增了从广东阳江地区猪体分离的食道口线虫 rDNA 的内转录间隔区(ITS)及 5.8S 序列。将 PCR 扩增出的片段纯化后克隆至 pGEM-T Easy 载体,用 PCR 技术及酶切鉴定阳性菌落,对阳性菌落质粒 DNA 进行测序。结果表明,扩增的片段大小为 828 bp,包含部分的 18S、28S 及全部的 ITS-1(362 bp)、5.8S(153 bp)及 ITS-2(217 bp)序列。序列比较表明,该食道口线虫为有齿食道口线虫。本研究在国际上首次报道了中国猪有齿食道口线虫的 ITS 及 5.8S 序列,为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。

倡导饲料不加抗球虫药，为实现饲料无抗铺路

由艾美耳球虫引起的鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的寄生虫病，目前其防控主要以抗球虫药为主，但长期和不规范的抗球虫药使用，导致了交叉和多重耐药性虫株的大量出现，鸡肉产品药物残留及环境污染等问题。本文从抗球虫药的耐药现状、药物残留风险和环境污染问题论述了我国抗球虫药物的使用困境，阐明了球虫疫苗优势以及推广应用需要解决的关键问题，倡导球虫疫苗替代抗球虫药防控策略，为实现饲料无抗铺路。

利用抑制消减杂交技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因

为了筛选线虫的性别特异性基因,为线虫乃至寄生虫的性别控制提供新的工具,本研究选择猪蛔虫(Ascarissuum)为模型,分别提取雌性和雄性成虫的mRNA后,采用Clontech公司的PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库,并采用地高辛(DIG)标记的cDNA探针进行Southern杂交检验所构建文库的消减效率。结果表明,雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库均具有很强的性别特异性。随机从各库中各抽取25个克隆进行测序及在线BLAST分析,发现在25个雄虫ESTs中有20个已知ESTs,5个新的ESTs;25个雌虫ESTs中有11个已知ESTs,还有8个可能为新基因。猪蛔虫性别差异表达的消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究性别特异基因的功能奠定了基础。

猪弓形虫病特异PCR诊断方法的建立

以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法。应用人工感染的方法建立了猪弓形虫病动物模型,摸索出猪弓形虫病PCR检测的最佳条件。敏感性和特异性试验结果显示,该PCR方法最低能检测到10 个弓形虫速殖子的DNA,且与相关的8种原虫和线虫均无交叉反应,证明该PCR方法具有高度的敏感性和特异性。动物感染试验结果证明,在试验猪出现明显临床症状时(感染后第5 d),对取材的8 个组织样品用该PCR方法检测,有6个组织样品为阳性,其中检出率最高的组织为肺门淋巴结。

中国弓形虫虫株529bp重复序列的PCR扩增、克隆及分析

【目的】首次对中国来源于不同宿主、不同地域的9个弓形虫虫株(ZS1人株、PY猪株、GY猪株、ZC猪株、NT猪株、ZS人株、SH人株、CN猪株、QHO绵羊株)以及国际标准强毒RH株之间在529bp重复序列的变异进行研究,从而为进一步的分子诊断和分子遗传学研究以及弓形虫病的防制奠定基础。【方法】抽提基因组DNA后,用PCR方法对10个虫株的529bp重复序列进行扩增;扩增产物经纯化后克隆于pGEM-TEasy质粒载体,再经菌落PCR及酶切鉴定阳性克隆,然后对阳性克隆进行测序及序列分析。【结果】10个弓形虫虫株的529bp重复序列都不完全相同,它们之间的核苷酸序列变异范围为0.8%～2.9%。变异主要位于第32～55位碱基之间,这些碱基变异与虫株的宿主来源、地域来源及毒力之间没有相关性。【结论】529bp重复序列可作为遗传标记,用于弓形虫与其它寄生虫的种间鉴定,但不适合用于研究弓形虫的种内遗传变异。

猪食道口线虫ITS-1和ITS-2rDNA的PCR-SSCP分析

以采自我国不同地区猪体的食道口线虫虫株为研究对象,PCR扩增出ITS-1和ITS-2序列片段,然后采用单链构象多态性(SSCP)方法分析PCR产物,对不同地区食道口线虫进行分子鉴定。所有样品经SSCP分析显示两种带型,第一种为有齿食道口线虫带型,另一种为未定种食道口线虫带型。代表性样品的测序结果表明,未定种食道口线虫带型的样品为四棘食道口线虫。本研究在国际上首次报道了中国猪四棘食道口线虫的ITS序列,并建立了区分有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的PCR-SSCP方法,从而为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。

弓形虫GRA4和SAG2基因重组BCG疫苗免疫保护性的比较研究

目的比较弓形虫致密颗粒蛋白4(GRA4)基因和表面抗原2(SAG2)基因的重组卡介苗(BCG)对小鼠的免疫保护效果。方法108只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分成6组:PBS组、BCG空白菌组、BCG-空白载体组、BCG-SAG2组、BCG-GRA4组和BCG-SAG2+GRA4组,每组18只。每鼠分别注射对应液体/疫苗100μl,共2次,间隔2周。接种前尾静脉采血,接种后4、6、8周每组分别剖杀3只,取脾和眼眶血检测细胞因子、IgG与IgM抗体,T淋巴细胞亚群计数,淋巴细胞转化率等。末次免疫后3周,每组剩余小鼠分别腹腔接种RH株弓形虫速殖子50个进行攻击感染,观察各组小鼠存活时间。结果弓形虫SAG2和GRA4重组BCG疫苗均能诱导小鼠产生免疫应答。第4周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值最高,为14.06%±1.17%。第6周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的IgG抗体水平最高,为0.18±0.02。第8周时,BCG-SAG2免疫组小鼠的IgM抗体水平最高,为0.82±0.05;弓形虫速殖子攻击后,BCG-SAG2组平均存活8.61d,PBS对照组平均存活7.33d,3个免疫组小鼠比其他3组的平均存活时间长1d。结论弓形虫重组BCG疫苗具有一定的免疫保护性。