武汉市1994~2022年HIV感染者/AIDS患者的生存时间及其影响因素

目的分析武汉市1994~2022年HIV感染者/AIDS患者(HIV/AIDS)生存时间及其影响因素,为进一步制定防治策略提供依据。方法收集国家艾滋病综合防治信息系统中武汉市1994~2022年直报的常住HIV/AIDS流行病学调查和抗病毒治疗数据,采用寿命表法、Cox比例风险回归模型对生存时间及其影响因素进行分析。结果纳入研究的8954例HIV/AIDS共随访47245.4人年,全死因死亡1078例,中位生存时间22.3年;第1、5、10、15、20年生存率分别为92.9%、88.5%、83.5%、78.7%、73.8%;Cox比例风险回归模型分析结果显示,未治疗、男性、较大年龄、无职业、低文化程度、本地户籍、异性性行为传播及注射吸毒传播、医疗机构检测发现及较低CD4基线水平是影响HIV/AIDS生存时间的危险因素,未治疗患者死亡风险为已治疗患者的13.979倍(95%CI:11.883~16.446),无职业患者死亡风险为有职业患者的1.140倍(95%CI:1.004~1.295),本地患者死亡风险是流动人口1.682倍(95%CI:1.415~2.000),医疗机构检测发现的患者死亡风险是自愿咨询检测患者的1.823倍(95%CI:1.421~2.339)。结论应针对50岁及以上、无职业、低文化程度、医疗机构检测发现及低CD4基线水平等危险因素,开展宣传教育提升大众对艾滋病的科学认识,并通过医防协同、社会组织参与等方式促进早检测、早治疗;充分利用HIV/AIDS人群健康大数据,形成多维度全生命周期健康档案,针对不同个体提供包括心理干预在内的精准医疗,延长生存时间和提高生活质量是今后努力的方向。

可溶性HLA-A2-肽复合物的体外折叠与生物素化

目的 :可溶性HLA A2 抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化。方法 :原核高效表达的HLAH链及 β2m,在抗原肽 (EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2 CLGGLLTMV COOH残基 )的存在下 ,通过稀释复性折叠成HLA A2 抗原肽复合物 ,并在BirA酶的作用下进行生物素化 ,使生物素结合到HLA A2 抗原肽复合物中的H链C端。利用特异性抗体 (mAbW6 / 32和兔抗人 β2m抗体 )及链霉亲合素进行ELISA和Westernblot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果 :折叠复合物中 ,主要含有HLAH链聚合体、HLA A2 肽复合物单体及 β2m3种成分 ,其中H链聚合体与HLA A2单体可生物素化。结论 :成功地获得生物素化的HLA A2 抗原肽复合物单体 ,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础 ,也为过程复杂的HLA

“细胞凋亡的诱导与检测”整合性实验的实践与探索

现行的医学教育改革和整合课程体系的实践，主要通过以器官或系统为主线进行基础知识的整合、基础与临床的结合，并综合应用灵活多样的教学形式，有效地改善了传统医学基础教育课程设置多、不同学科之间交叉重复，以及课程教授形式单一等问题对教学效果的影响，体现了国际医学教育的发展趋势，在培养医学生系统与主动的学习医学知识以及创新能力挖掘方面显示出了较大的优势[1,2]。

HGPRT缺陷型T淋巴瘤细胞系的建立与鉴定

目的通过突变诱导次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷型的T淋巴瘤细胞系,为制备T细胞杂交瘤提供利于筛选的亲代细胞。方法通过乙基甲磺酸对Jurkat细胞进行突变,逐步提高培养液中6-巯基鸟嘌呤(6-TG)的浓度,筛选出对6-TG具有稳定抗性的单克隆细胞株Jur16-TG细胞。比较Jurkat细胞与Jur16-TG细胞在含6-TG培养液和HAT培养液中的生长情况。结果在含20μg/ml 6-TG的培养液中,Jur16-TG细胞能够稳定生长,而Jurkat细胞在培养1周后基本死亡。在HAT培养液中氨基喋呤的浓度为4×10-8mol/L或8×10-8mol/L时,Jur16-TG细胞4 d内基本死亡,而Jurkat细胞至少能存活7~10 d。Jur16-TG细胞与正常外周血淋巴细胞(PBL)的融合实验显示,35%的Jur16-TG细胞与PBL融合。结论突变筛选出的单克隆细胞株Jur16-TG具有6-TG抗性和在HAT培养液中不能生长的特性,证实该细胞为HGPRT缺陷型细胞株,并且该细胞株可有效地与原代淋巴细胞融合,从而为T细胞杂交瘤的制备提供了利于筛选的亲代永生化的T细胞。

sHLA-A*0201-抗原肽四聚体的构建与功能检测

目的:构建有功能的sHLA-A*0201-抗原肽四聚体,建立一套HLAⅠ类分子/抗原肽的四聚体制备技术。方法:利用基因工程及体外折叠技术构建sHLA-A*0201-LMP2A426-434复合物分子,并在BirA酶的作用下生物素化,与荧光标记的亲和素衍生物以分子数4∶1结合而形成HLA-A*0201-LMP2A426-434四聚体。获得的四聚体对长期混合淋巴细胞培养中增殖的抗原特异性CTL进行检测,同时用细胞毒实验验证。结果:荧光标记的亲和素与生物素化的HLA-A*0201-抗原肽复合物分子正确结合,制备的四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的特异性T细胞结合。结论:从结构与功能上证实成功地获得有功能的HLA-A*0201-抗原肽复合物四聚体。为进一步研究T细胞识别机制与功能奠定了基础,也为过程复杂的HLA-抗原肽四聚体制备提供了可行的免疫学监控方法。

新冠疫情下有效网络教学设计促进基础医学课程“以学生为中心”的教学改革

在2020春新冠疫情大环境下,教育部“停课不停学”的政策触发网络教学的大规模开展,以华中科技大学医学免疫学9个网络教学课堂为调查对象,结果显示疫情期间网络教学方式推进师生对教学软件、平台以及资源的充分利用,有效网络教学设计让学生深刻体会到参与式教学的优点,为后期进一步开展与完善“以学生为中心”的教学改革奠定了良好的基础。

人β_2m基因的克隆及表达

目的 克隆和表达HLA I类分子轻链(β2m)基因,为人工制备HLA I类分子提供基础。方法 利用逆转录PCR技术从Jeg-3细胞株中克隆β2m基因,与质粒pET22b(+)重组,构建原核表达载体pET22b(+)-β2m,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),诱导β2m基因高效表达,并采用双抗体夹心ELISA法对表达产物进行抗原性和功能鉴定。结果 酶切和测序证实β2m基因克隆和载体构建成功,目的蛋白在宿主菌中高效表达于包涵体中;通过包涵体的分离和纯化获得初步纯化的β2m,所制备的β2m能够与特异性抗体结合,并能与HLA I类分子重链形成具有天然构象的HLA I类分子。结论 人β2m基因能够在原核宿主中高效表达,表达产物具有形成HLA I类分子的功能。

BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定

目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。

医学免疫学理论课多平台混合式在线教学的应用与体会

新冠疫情突发,在校教学无法如期开展,在线教学成为医学免疫学理论课的首选。为保证教学任务的顺利完成,本教学团队采用了多平台混合式在线授课方式,即依托腾讯课堂,开展线上面对面直播教学,同时依托慕课课堂进行预习、复习和测验,依托QQ群通讯联络。该方式保证了课程的整体性、系统性和教学质量,达到了预期教学目标。

生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备

目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物。方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在BirA酶作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA-A*2402-抗原肽复合物单体。利用特异性单克隆克体(W6/32和兔抗人2β微球蛋白抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-肽复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-肽复合物单体可生物素化。结论成功制备出生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础。

sHLA-A*020-1抗原肽复合物的构建

以原核表达的sHLA A 0 2 0 1 BSP为重链 ,β2 m为轻链 ,与人工合成的EBV抗原肽LMP2A (4 2 6 4 34、NH2 CLGGLLTMV COOH )利用稀释法进行共折叠复性 ,形成可生物素化的可溶性HLA A 0 2 0 1抗原肽复合物。并利用仅与天然构象HLAI类分子结合的单抗W6 / 32 ,通过Dot ELISA和Westernblot对折叠产物的构象进行鉴定 ,证实复性后成功获得了天然构象的sHLA A 0 2 0 1 抗原肽复合物。为进一步组装可溶性HLA/抗原肽四聚体以及制备人工抗原提呈细胞奠定基础。

sHLA-A*2402融合蛋白的制备与特性研究

本文用含有HLA-A*2402重链胞外段基因的质粒为模板进行PCR,利用下游引物拼接上依赖BirA的可生物化序列后,构建融合基因sHLA-A*2402-BSP,与质粒pET-21d重组后,在宿主菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达的融合蛋白与β2m及HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行复性折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并用Westernblot和夹心ELISA法鉴定。证实成功地制备出sHLA-A*2402-生物素化序列融合蛋白并使之正确折叠复性。为研究在原核系统中表达、纯化与复性及体外构建MHCI类分子四聚体,探讨免疫识别机制奠定了基础。

可溶性HLA-G1-肽复合物的体外折叠和鉴定

目的合成可溶性HLA-G1-肽复合物。方法利用原核高效表达的可溶性HLA-G1重链和轻链(β2m),在人工合成的HLA-G1限制性九肽(KGPPAALTL)存在的条件下,通过稀释复性折叠成可溶性HLA-G1-肽复合物。利用特异性抗体(W6/32及兔抗人β2m抗体)进行免疫印迹及酶联免疫吸附试验,检测稀释复性的折叠产物。结果折叠复合物含有35%可溶性HLA-G1-肽复合物、5%可溶性HLA-G1重链聚合体及60%复性的β2m3种成分。结论通过原核表达、体外折叠能够获得大量可溶性HLA-G1-肽复合物。

加载HPV6E7抗原肽的HLA-A2单体及其四聚体的制备和鉴定

目的制备可生物素化的可溶性HLA-A2/HPV6E7单体,进一步组装成PE标记的可溶性HLA-A2/HPV6E7四聚体。方法以原核表达的sHLA-A2BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的HPV6E7(22-30)抗原肽(GLH-CYEQLV)利用稀释法进行共折叠复性得到单体。利用HLAI类分子单抗(W6/3)和抗Bzm抗体进行Westernblot和ELISA鉴定折叠产物的构象。以BirA酶对其进行生物素化,经过超滤离心后得到纯化的sHLA-A2/HPV6E7单体,再与Streptavidin-PE按4:1比例混合形成四聚体。结果该四聚体具有与HLA-A2阳性HPV6感染的CA患者的抗原特异性CTL结合活性。结论成功获得了天然构象的sHLA-A2/HPV6E7单体及PE标记的HLA-A2/HPV6E7四聚体。

通过两步离子交换层析建立保留HLA-A2二聚体构象的纯化方法

目的建立两步离子交换层析纯化方法以获得浓缩的高纯度HLA-A2二聚体。方法收集转染有HLA-A2-IgG1 Fc重组基因的7A2D细胞上清,并进行ELISA和Western blot鉴定7A2D细胞表达的HLA-A2二聚体,检测其浓度;应用SPA亲和层析和两步法离子交换层析技术分别纯化HLA-A2二聚体,并比较2种方法纯化HLA-A2二聚体的效率。结果7A2D细胞可表达正确构象的HLA-A2二聚体,Western blot检测显示融合蛋白的分子量与预期大小一致,7A2D细胞上清中HLA-A2二聚体的浓度为4.4μg/mL。SPA亲和层析法中pH3.0的洗脱条件使大部分的HLA-A2二聚体发生了变性反应,纯化后构象正确的HLA-A2二聚体纯度为(10.4±1.3)%,回收率仅为(7.3±1.1)%;两步离子交换层析后HLA-A2二聚体纯度为(72.9±4.6)%、回收率为(51.9±6.5)%,均显著高于SPA亲和层析法。结论建立了一种纯化条件相对温和的两步法离子交换层析纯化方法,经过该方法制备获得的高纯度与较高浓度的HLA-A2二聚体可保持正确的空间构象,达到纯化与浓缩的目的。

可溶性HLA-G-肽复合物的体外制备与纯化

目的探讨可溶性HLA-G-肽复合物的体外制备与纯化。方法原核高效表达的HLA-G重链及轻链(β2m)在抗原肽(人工合成九肽NH2-KGPPAALTL-COOH)的存在下,通过稀释复性折叠成HLA-G-肽复合物,采用凝胶过滤层析对折叠复合物进行纯化。利用特异性抗体(mAb W6/32和兔抗人β2m抗体)进行ELISA和Western blot对纯化产物进行鉴定。结果折叠复合物中,主要含有HLA-G重链聚合体、HLA-G-肽复合物及β2m3种成分,纯化后主要为HLA-G-肽复合物。结论成功地获得纯度较高的可溶性HLA-G-肽复合物单体,为进一步研究HLA-G的生物学功能奠定了基础。

基于疾病模型的整合性免疫学实验教学的实践与探讨

目的:探讨基于疾病模型的整合性实验课教学模式。方法:41名对照组学生采用传统的教学模式,49名实验组学生采用基于疾病模型的整合性实验教学模式。通过试卷考试和问卷调查方式比较两组的教学效果。结果:实验组理论课与实验课考试成绩均显著高于对照组,对实验教学的评价优于对照组。结论:基于疾病模型的整合性实验教学模式值得推广。

骨科门诊患者疼痛的护理

目的:探讨减轻骨科门诊患者疼痛的护理方法及措施。方法:对疼痛原因进行分析,分别采取心理护理及适当的药物镇痛、预防性用药等护理措施进行干预。结果:通过药物镇痛、预防性用药及护理,使患者思想轻松,提高了疼痛的阈值,增加了患者对疼痛的耐受力,减轻了患者的痛苦,减轻了其对机体的有害影响。结论:正确认识疼痛,掌握骨科领域各种原因所致疼痛的特点,有效地止痛,对骨科门诊患者十分重要。

HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化

目的构建HLA-DR1(由DRA和DRB1*01基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达。方法采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoRⅠ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体。分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc]。对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序。采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Westernblot检测HLA-DR1的表达。结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致。ELISA和Westernblot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象。结论成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础。