人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达

目的 构建HPV 18L1 E6、L1 E7嵌合基因的表达载体 ,并在CHO细胞中表达。方法 克隆HPV 18L1 E6和L1 E7基因 ,插入中介载体 pGEMT Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法 ,突变L1 E6、L1 E7基因序列中与转化作用相关的位点 ,分别与L1基因连接后插入真核表达载体 pVAX1,构建真核表达质粒 pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx。用磷酸钙沉淀法 ,转染CHO细胞 ,以抗HPV 18L1、抗E6和抗E7特异性单克隆抗体 (mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测。结果 ELISA检测显示 ,转染各种pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P N值均 >2 .1;免疫细胞化学检测 ,在胞浆、胞核可见棕黄色颗粒。结论 所构建的 pVAX1 L1E6Mxx E7Mxx融合蛋白表达质粒 ,可在转染细胞内表达相应的L1 E6Mxx和L1 E7Mxx蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础。

突变型人肿瘤坏死因子-α工程菌发酵培养的实验研究

目的 优化基因重组人突变型 4 71肿瘤坏死因子 α(TNF α)工程菌的发酵和表达条件。方法 通过改变培养基的组分、pH值、培养温度和诱导表达的条件等 ,采用测定细菌生物量和蛋白表达量等方法 ,确定最适的发酵和表达条件 ,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果 突变型 4 71rhTNF α工程菌在 pH值 7.5的SOC培养基中 ,30℃培养、4 2℃诱导 5h时 ,其表达量最大。而且 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,目的蛋白的表达不受影响。结论 优化了基因重组人突变型 4 71rhTNF α工程菌的发酵和表达的最适条件 ,为进一步开发人突变型 4 71rhTNF

白细胞介素6抗肿瘤作用的实验研究

用S180腹水瘤动物模型,经IL-6治疗后绝大多数肿瘤消退(8/10),且用同一肿瘤再次攻击不能生长,对照组中大多数小鼠因肿瘤进展而死亡(9/10).经S180肉瘤再次攻击的动物脾脏明显肿大,约为对照组的4倍以上,镜下观察脾脏白髓明显增生,牌中央动脉周围淋巴鞘明显增大,主要由大淋巴细胞及免疫母细胞构成,与薄层小淋巴细胞构成的边缘区分界明显,而脾小结的淋巴滤泡亦可见明显的生发中心.体外细胞毒测定显示:实验组脾细胞对S180靶细胞的杀伤作用明显高于对照组(907±318:387±144,P=0.003).对L929靶细胞的细胞毒亦是如此(1145±164:186±251,P<0.001).提示IL-6在活体内可激发荷瘤宿主对肿瘤的免疫反应.体外经IL-6处理的人PBL及人瘤靶细胞,亦明显增强效应细胞的杀伤活性.有趣的是这一现象主要是肿瘤细胞对效应细胞的杀伤敏感性增加,其机制可能是通过增强细胞间识别分子表达,诱发效应细胞对肿瘤的免疫应答来实现.

人乳头瘤病毒18型L1-E6、E7嵌合基因DNA疫苗的体内免疫效应

目的 :检测HPV 18L1 E6、E7嵌合基因DNA疫苗在小鼠体内的体液和细胞免疫效应。方法 :将实验动物BALB/c小鼠 5 4只随机分为 9组 ,按不同免疫方式 (肌肉接种或鼻内滴注 )分别给予不同的重组质粒 (pVAX1 L1 E6M3或pVAX1 L1 E7M3)和免疫佐剂 (pLXHDmB7 2或LTB)。用免疫原免疫 3次 ,末次免疫后取眼球后血进行ELISA抗体检测。末次免疫后进行小鼠足垫迟发型超敏反应 (DTH)试验。断足进行小鼠足垫HE染色。取小鼠脾脏制成单细胞悬液 ,进行脾细胞增殖试验 ,并进行CD4 + /CD8+ T细胞中IFN γ+ 或IL 4 + 细胞的FACS分析。结果 :与对照组相比 ,各实验组均获得明显的免疫效果。实验组免疫后血清抗体A值均高于相应组别免疫前 ;肌肉注射组每次免疫后抗体水平较前次明显升高。实验组小鼠注射VLP抗原的左后足垫局部有红肿硬结 ,镜下观察可见大量单核细胞侵润。肌肉接种组的DTH反应强度、脾细胞增殖刺激指数 (SI)和CD8+ IFN γ+ 细胞数均高于鼻内滴注组 ;而鼻内滴注组CD4 + IL 4 + 细胞数高于单纯质粒肌肉接种组 ;加入pLX HDmB7 2的联合免疫组各项指标均高于单纯质粒组。结论 :证实了重组pVAX1 HPV18L1/E6、E7嵌和基因DNA疫苗能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫效应。同时 ,证实B7 2分子能显著提高该质粒在小鼠体内的免疫反应?

人重组TNF-α突变体471蛋白的初步纯化及生物学活性

目的 :在利用原核表达系统表达重组人突变体 4 71TNF α蛋白的基础上 ,对该蛋白进行初步纯化及生物学活性检测。方法 :利用最佳发酵和表达条件 ,诱导基因重组的人突变体4 71TNF α工程菌表达目的蛋白。收集菌体 ,经超声破碎 ,分离人突变体 4 71TNF α的包涵体 ,并观察变性剂及蛋白浓度对蛋白折叠的影响。采用MTT比色法检测并比较人野生型及突变体 4 71TNF α的生物学活性。结果 :在适当的变性与复性条件下 ,已成功地将突变体 4 71TNF α折叠并聚合形成具有生物学活性的三聚体。突变体 4 71TNF α对L92 9的细胞毒活性高于野生型TNF α的 15倍。结论 :原核表达系统中表达的人突变体 4 71TNF α经复性处理后具有显著的生物学活性 。

重组人突变型471TNF-α及野生型TNF-α的表达及活性初步鉴定

目的 采用原核表达系统 ,表达人突变型 471TNF α蛋白 ,并检测其生物学活性。方法 采用PCR技术扩增突变型 471TNF α及野生型TNF αcDNA片段 ,克隆入中间载体pUCm T中 ,并测序证实。以限制性内切酶切下目的片段 ,克隆入pBV2 2 0中 ,转入大肠杆菌DH5α ,温度诱导表达野生型及突变型 471TNF α蛋白。初步纯化蛋白后 ,采用MTT法评估两者对L92 9细胞的杀伤作用。结果 ①获得了测序正确的野生型TNF α及突变型 471TNF α的cDNA克隆 ;②构建了正常人野生型TNF α及突变型 471TNF α重组表达质粒 ;③经温度诱导 ,TNF α及突变型 471TNF α蛋白均获得了表达 ;④初步的生物学活性研究表明 ,突变型 471TNF α蛋白的杀伤作用显著高于野生型。结论 突变型 471TNF α的生物学活性优于野生型TNF α ,为进一步开展TNF

白血病瘤苗对小鼠细胞毒性T淋巴细胞作用的研究

目的 探讨自制的一种白血病疫苗对C57BL/ 6小鼠细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)杀伤功能的影响。方法 建立白血病荷瘤小鼠模型 ,用自制的 3种不同的白血病疫苗进行预防或主动免疫治疗 ,用MTT比色法检测预防或治疗 2周、4周后小鼠CTL杀伤活性 ,并与对照组相比较。结果 ①随着白血病细胞在小鼠体内的生长 ,小鼠的CTL杀伤功能受到严重抑制。②灭活肿瘤细胞 +IFA +细胞因子 (rGM CSF +rIL 2 +rIL 6)的肿瘤疫苗在提高小鼠CTL的杀伤功能方面 ,优于灭活肿瘤细胞 +IFA肿瘤疫苗 ,而仅含灭活肿瘤细胞的疫苗作用不明显。结论 灭活肿瘤细胞 +IFA +细胞因子 (rGM CSF +rIL 2 +rIL 6)的肿瘤疫苗可以激活以CTL为代表的特异性细胞免疫功能 。

HIV-1病毒样颗粒真核表达系统的建立

目的利用哺乳动物细胞表达HIV-1病毒样颗粒,为HIV-1病毒的生物学研究和进一步设计HIV-1中和优势表位预防性疫苗奠定基础。方法以293T细胞作为宿主细胞,利用磷酸钙沉淀法将带有HIV-1病毒被膜蛋白gp160基因的pcDNA3.1/BaL gp160真核表达载体和带有HIV-1核心蛋白(gag)的pVRC3900真核表达载体共转染至293T细胞中,收集培养上清,经蔗糖不连续梯度离心,收集病毒样颗粒,经磷钨酸负染,透射电镜观察结果。结果以磷酸钙沉淀DNA转移技术,EGFP真核表达质粒为靶基因,293T细胞为宿主细胞,最佳转染效率达30%以上;将pcDNA3.1/ BaL gp160(env)和pVRC3900(gag)真核表达质粒共转染,宿主细胞成功表达目的蛋白,转染细胞培养上清经蔗糖密度梯度离心,电镜观察可见自行装配的HIV病毒样颗粒。结论在真核细胞中表达HIV-1病毒样颗粒。

TIL治疗人体进展期肿瘤后的免疫学监测

对8例晚期恶性肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分离、培养至l0°细胞以上．再重输给病人，同时应用小剂量IL-2,在治疗前一周及治疗后一个月采集病人外周静脉血、分离单个核细胞作为效应细胞，选用一组不同类型人肿瘤细胞株为靶细胞．以MTT比色法测定效应细胞对靶细胞的杀伤活性，同时分析效应细胞表型变化．结果显示．治疗后对不同靶细胞的杀伤活性均有不同程度提高。最有趣的是对与病人有相同组织学类型的瘤细胞的杀伤活性显著提高(43升高到1249溶解单位p<0．06)，用T4、T8单抗双染流式细胞仪分析表明T4、T8细胞表面荧光强度明显增强(T4：l9→3．98．T8：445→7．2 p<0．06)。提示TIL能够明显上调病人的免疫状况．其作用途径除直接的细胞毒效应外．免疫调节作用可能是其主要效应途径。

白血病瘤苗对荷瘤小鼠细胞免疫功能影响的研究

目的 :探讨白血病细胞疫苗主动免疫治疗在血液恶性肿瘤中的作用。方法 :建立红白血病荷瘤小鼠 ,用自制的 3种不同的白血病细胞瘤苗进行主动免疫治疗 ,用MTT比色法测其治疗 2周和 4周的小鼠Mφ和CTL的杀伤活性 ,并与对照组相比较。结果 :①随着肿瘤细胞在小鼠体内的增长 ,小鼠的细胞免疫功能受到严重抑制 ,特异性细胞免疫功能的抑制滞后于非特异性细胞免疫功能。②灭活肿瘤细胞 +IFA +细胞因子 (rGM CSF +rIL 2 +rIL 6 )的肿瘤疫苗在提高荷瘤小鼠的细胞免疫功能方面 ,尤其是特异性细胞免疫功能方面优于灭活肿瘤细胞 +IFA肿瘤疫苗 ,而仅含灭活肿瘤细胞的疫苗作用不明显。结论 :灭活肿瘤细胞 +IFA +细胞因子 (rGM CSF +rIL 2 +rIL 6 )的肿瘤疫苗在血液恶性肿瘤的特异性主动免疫治疗中很有潜力。

白血病瘤苗对正常小鼠免疫作用的观察

目的 观察自制的一种白血病瘤苗对C57BL/ 6小鼠一般状况 、抵御FBL 3细胞的攻击及小鼠免疫功能的影响。方法 用自制的白血病疫苗 ,内含灭活的FBL 3细胞 +不完全弗氏佐剂 (incompletefoundadjuvant,IFA) +细胞因子(rIL 2、rIL 6、rGM CSF) ,皮下注射免疫C57BL/ 6小鼠 ,用FBL 3细胞皮下注射攻击小鼠 ,观察小鼠一般状况、成瘤率、瘤块生长情况 ;用病理学方法了解瘤块及疫苗注射部位病理变化 ;用MTT比色法检测小鼠巨噬细胞 (macrophage ,Mφ)及细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)杀伤活性。 结果 与对照组相比 ,发现自制成的白血病瘤苗能有效的提高小鼠的细胞免疫功能 ,Mφ及CTL杀伤活性明显提高 ,用FBL 3细胞攻击 ,小鼠成瘤率低 ,成瘤小鼠瘤块生长缓慢 ,瘤周单个核细胞浸润明显 ,瘤块内瘤细胞坏死明显。结论 所用白血病疫苗制备简单 ,疗效肯定 ,副作用小 。

白血病瘤苗对小鼠巨噬细胞作用的研究

目的 :探讨自制的一种白血病瘤苗对C5 7BL 6小鼠Mφ杀伤功能的影响。 方法 :建立白血病荷瘤小鼠模型 ,用自制的 3种不同的白血病瘤苗进行预防或主动免疫治疗 ,用MTT比色法检测预防或治疗 2周、4周后小鼠Mφ杀伤活性 ,并与对照组比较。结果 :(1)随着白血病细胞在小鼠体内的生长 ,小鼠的Mφ免疫功能受到严重抑制。 (2 )灭活肿瘤细胞 +IFA +细胞因子 (rGM CSF +rIL 2 +rIL 6 )的肿瘤疫苗在提高小鼠的Mφ免疫功能方面 ,优于灭活肿瘤细胞 +IFA肿瘤疫苗 ,而仅含灭活肿瘤细胞的疫苗作用不明显。结论 :灭活肿瘤细胞 +IFA +细胞因子 (rGM CSF +rIL 2 +rIL 6 )的肿瘤疫苗可以激活以Mφ为代表的非特异性细胞免疫功能 ,如非特异性细胞毒、免疫监视、抗原递呈等功能 ,为进一步活化T淋巴细胞打下基础 ,此种疫苗在血液恶性肿瘤的特异性主动免疫治疗中很有潜力。

急性白血病的新型主动免疫治疗研究

目的应用化疗不能治愈大多数急性白血病，近年人们对基因工程疫苗寄以厚望，动物实验已展现其具有明显疗效，但迄今尚未见单独应用白血病疫苗主动免疫及治疗急性白血病患者取得明显疗效的报造。本文应用基因工程生产的细胞因子及白血病细胞制备的疫苗，主动免疫治疗21例急性白血病，以探讨提高主动免疫治疗急性白血病疗效的方法。方法1．新型白血病疫苗制备：取化疗前或化疗末缓解的白血病患者自身骨髓15ml，肝素抗凝，应用淋巴细胞分离液分离出富含白血病细胞的骨髓单个核细胞，经丝裂霉素处理后，加入含基因工程生产的粒单细胞集落刺激因子，白细胞介素2及白细胞介素6等的福氏佐剂中。2．主动免疫治疗程序：对所有接受免疫治疗患者在停用化疗两周后进行骨髓检查并开始接种疫苗。每次用合108个白血病细胞的疫苗1．6ml，分两点前臂皮下注射，每隔7天重复一次，共4次，然后长期随访。如无效时再改用其它治疗；如有效，每隔6个月加强注射一次。结果21例急性白血病患者均因化疗无效或不能耐受而改用疫苗治疗。免疫治疗达到完全缓解（CR）者5例，为24％；部分缓解（PR）者4例，为19％；微效（MR）者3例，为14％。总有效率达到57％。有效者多为女性，低增生性急性单核细胞白血病（M5）。疗效平均持续时间约7?

在单个细胞水平上对非小细胞肺癌胸水淋巴细胞细胞因子的表达

目的 分析非小细胞肺癌癌性胸水细胞中影响免疫状态的 7种细胞因子的表达 ,初步探讨肿瘤局部免疫微环境对抗肿瘤免疫应答的影响 ,揭示肿瘤逃逸机制。方法 应用原位杂交技术检测非小细胞肺癌癌性胸水和结核性胸膜炎炎性胸水细胞中IL 2、INF γ、IL 1 2、IL 1 8、IL 1 0、IL 4、TGF β1mRNA表达 ,比较其差异并进行半定量分析。结果 非小细胞肺癌癌性胸水细胞中IL 1 0、TGF β1、IL 4表达者显著高于IL 2、INF γ、IL 1 2、IL 1 8,且显著高于对照组。结核患者表达的各细胞因子水平均较低 ,且各因子的表达细胞数量相互间无显著性差异。结论 非小细胞肺癌患者癌性胸水细胞中Ⅱ型细胞因子表达者占主导地位 ,IL 1 0和TGF β1共同高表达 ,提示二者可能共同作用 。

B7.1cDNA基因免疫抗移植瘤生长的实验研究

采用分子生物学、细胞生物学及病理学技术,研究B7.1cDNA基因免疫对移植瘤生长状况的影响。在实验中首先提取、纯化B7.1cDNA真核表达质粒,经鉴定证实后以其免疫小鼠。在免疫鼠背部皮下接种SP2/0细胞,观察移植瘤在实验鼠体内生长状况。结果见B7.1cDNA免疫组接种SP/0细胞后,肿瘤的发生率仅为8％,明显低于对照组(100％),且免疫组小鼠的肿瘤生长缓慢,小鼠存活时间延长,经统计学处理,其结果有显著性差异,提示B7.1cDNA基因免疫有明显的抗移植瘤生长作用。

人乳头瘤病毒18型L_1基因果蝇表达系统的构建和鉴定

目的:利用基因重组技术,构建人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1基因果蝇表达质粒。方法:以pUC18-HPV18为模板,运用PCR方法扩增不含核定位序列的HPV18L1DNA片段;PCR产物连接至PGEM-TEasy质粒,并测序鉴定;将测序正确的HPV18L1DNA片段亚克隆到果蝇表达载体pMT/BiP/V5-HisA中;利用酶切及PCR方法鉴定重组质粒。结果:经双酶切及PCR鉴定,证实成功构建重组果蝇表达质粒pMT/BiP/V5-HPV18L1。结论:pMT/BiP/V5-HPV18L1重组果蝇表达质粒为下一步转染果蝇S2细胞及制备HPV18VLPs奠定了基础。

人IL-18cDNA克隆及原核表达

目的 从外周血单核细胞中克隆人IL 1 8成熟编码序列cDNA ,对其进行测序并构建原核表达载体 ,进行原核表达。方法 从人外周血单核细胞中分离总RNA ,进行RT PCR获得人IL 1 8cDNA。测序证实其结果正确后 ,构建原核表达载体。E .coli的表达产物通过SDS PAGE、WesternBlot证实。结果 所克隆的人IL 1 8cDNA编码序列经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致 ,细菌表达产物经SDS PAGE证实其大小约为 1 8.3KDa,WesternBlot进一步证实了所表达产物的正确性。结论 本研究结果为进一步探讨IL 1 8的生物学活性和特性奠定了基础 ,同时亦为利用人IL 1 8进行免疫基因治疗的研究打下了良好的基础。

穿孔素对不同肿瘤细胞的杀伤作用

目的 研究穿孔素对不同肿瘤细胞株的杀伤作用是否一致 ,以确定肿瘤细胞对穿孔素的杀伤是否有抵抗作用。方法 大量培养LAK细胞 ,制备含穿孔素毒性颗粒的LAK细胞裂解物 ,用红细胞裂解试验证实LAK细胞裂解物的杀伤活性。培养穿孔素敏感的K5 6 2肿瘤细胞株和穿孔素不敏感的Hela、MGC80 3肿瘤细胞株 ,用流式细胞计数的方法研究LAK细胞裂解物对3种不同肿瘤细胞的杀伤作用。结果 红细胞裂解试验证实 ,LAK细胞裂解物具有杀伤活性 ;抗人穿孔素 (Humanperforin ,HP)McAbs可封闭LAK细胞裂解物对不同肿瘤细胞株的细胞毒作用 ;LAK细胞裂解物对K5 6 2细胞的杀伤是通过穿孔素依赖途径的。结论 穿孔素对K5 6 2、Hela和MGC80 3肿瘤细胞的杀伤明显不同 ,说明肿瘤细胞存在对穿孔素的抵抗机制。

HPV16 L1／L2蛋白单克隆抗体的制备

用真核表达的ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２蛋白作为抗原，经免疫、融合、选择性培养、克隆化等过程，我们建立了两株抗ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２蛋白的杂交瘤细胞株（另有数株仍在建株中）。免疫斑点法检测证明，它们产生的抗体，只与ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２蛋白起反应，而不与ＨＰＶ１６Ｅ６、Ｅ７蛋白、人血清蛋白和牛血清蛋白起反应。另外，免疫组化试验证明，这种抗体可应用于临床ＨＰＶ１６感染的检验，具有敏感、特异、准确、快捷、经济的优点。