一株2型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其在MDBK细胞上的克隆纯化

为了解牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在猪用活疫苗生产过程中的污染情况,利用抗原捕获ELISA方法对用于制作原代睾丸细胞的犊牛血清进行检测。将检测结果为阳性的1份犊牛血清,接种于MDBK细胞上,盲传3代,出现明显细胞病变。用BVDV 5′-UTR端特异性引物进行RT-PCR扩增,并对扩增片段进行克隆测序和序列分析。结果表明,分离得到一株2型牛病毒性腹泻病毒,并将其命名为JN-2。将该病毒用蚀斑方法进行克隆纯化,并对纯化前后病毒的TCID50进行测定比较,结果发现纯化后病毒滴度显著提高。

鸡α干扰素基因的原核和真核表达载体的构建及鉴定

目的:为了构建鸡α干扰素基因真核和原核表达载体。方法:参照Genebank中发表的鸡源α干扰素基因进行密码子优化后,人工合成α干扰素基因片段489 bp,成功构建了干扰素基因克隆载体p MD18-T-IFN-α,经双酶切后,回收获得干扰素基因,分别与原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p GAPZαA连接,转化到大肠杆菌Ressota和毕赤酵母中,分别进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:成功构建了原核表达载体p ET-28a-IFN-α和真核表达载体p GAPZαA-IFN-α。结论:成功构建了鸡IFN-α基因的真核和原核表达载体,为鸡IFN-α干扰素的抗病毒活性研究提供了基础。

大黄体外抗猪流行性腹泻病毒的研究

为研究大黄对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染所引起的细胞病变的抑制作用及其机理,本试验采用形态学观察法测定大黄溶液在Vero细胞上的最大安全浓度,建立体外病毒感染Vero细胞模型并利用该模型进行了大黄对病毒抑制作用的研究。结果显示,本试验成功建立了体外病毒感染模型和大黄的抗病毒试验方法;大黄在Vero细胞上的最大安全浓度为3.28mg/mL;形态学观察法和MTT法均显示大黄不仅能阻断病毒吸附Vero细胞,抑制病毒的合成复制,还可直接灭活病毒。本研究结果表明,大黄具有抗PEDV的作用,为临床上预防和治疗猪流行性腹泻(PED)提供理论基础。

重组鸡α-干扰素的表达及其生物活性的初步研究

为获得重组鸡α-干扰素并对其进行生物活性研究,本试验对重组大肠杆菌进行诱导表达,收集重组鸡α-干扰素包涵体后进行复性纯化及免疫印迹试验,并通过测定病毒EID50,在接种H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的鸡胚中进行干扰素抗病毒活性试验,运用微变量细胞病变抑制法进行重组鸡α-干扰素抗病毒效价的测定。结果显示复性后重组鸡α-干扰素的免疫印迹试验成功获得了预期条带,在鸡胚中重组鸡α-干扰素具有显著的抗H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等活性作用。在CEF/VSV细胞系上测定重组鸡α-干扰素的抗病毒效价为1.5×210 U/mg左右,高浓度重组鸡α-干扰素具有一定的细胞毒性。结果表明重组鸡α-干扰素蛋白具有免疫原性和抗原性,在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果,呈广谱性,抗病毒效价较高,为下一步抗病毒制品的创制奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV N蛋白,亲和层析纯化后作为包被抗原,通过对各反应条件优化选择,建立了PRRSV血清抗体的间接ELISA检测方法,并进行了交叉反应和重复性试验,以及同类成品试剂盒间的应用效果对比试验。最终确定了抗原包被最佳浓度为2μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,血清及酶标二抗孵育时间均为30min,显色时间为10min,检测猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒等5种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该ELISA检测方法批内和批间重复性的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒效果比较显示符合率为94.7%。本研究建立的间接ELISA方法将为猪群感染野毒PRRSV后的快速诊断及流行病学调查提供一种简便易行、快速高效的血清学抗体检测方法。

猪源植物乳杆菌的诱变选育及其对小鼠免疫性能的影响

为了获得1株具有较好耐酸耐胆盐、体外黏附率较高的植物乳杆菌,研究其对小鼠免疫性能的影响,试验将植物乳杆菌进行紫外诱变,对其耐酸和耐胆盐性能进行选育,将植物乳杆菌选育株BL-15冻干后,定量溶解,分3次口服(灌胃)BALB/c小鼠,采集血液、脾脏、粪便,处理后测定小鼠免疫性能指标的变化情况。结果表明,经过诱变后,从17株诱变株中成功筛选获得了1株耐酸耐胆盐较好、体外黏附率较高的植物乳杆菌BL-15,经小鼠口服后,提高了小鼠生长初期的脾脏指数及细胞因子IL-2的含量,加强免疫后肠内容物中SIgA含量与对照组相比,均差异显著(P<0.05)。说明该菌株可以诱导小鼠产生良好的黏膜免疫应答,提高小鼠的免疫性能。

禽流感H9亚型一步法RT-PCR快速检测试剂盒的研制及应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的禽流感H9检测方法,本研究根据GenBank中收录的禽流感H9病毒高度保守的基因序列,设计1对H9的特异性引物,建立了一步法快速检测禽流感的PCR,对反应条件进行优化后,组装成快速检测试剂盒,并对临床收集的疑似禽流感病料进行检测。结果显示,试验成功建立了禽流感H9病毒一步法RT-PCR检测方法,在此基础上完成了试剂盒的组装,对30份疑似禽流感病料的检出率高达98%以上,检测灵敏度达101.5 ELD50,稳定性良好,冷冻保存期达12个月。经证实该试剂盒具有操作简便、经济、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点,值得推广应用。

中草药和益生菌复方制剂对肉鸡法氏囊生长发育的影响

旨在研究中草药和益生菌复方制剂对肉鸡体重、法氏囊指数、法氏囊组织结构及淋巴细胞增殖活性的影响。选用5日龄健康AA肉仔鸡120只,随机分3组,对照组自由饮水,试验组分别添加0.1%和0.2%的中草药(黄芪、淫羊藿、党参)和益生菌复方制剂,试验期为3周。结果显示,各处理组肉鸡的法氏囊指数均明显高于对照,14日龄,0.1%和0.2%添加组法氏囊指数分别比对照高出41.96%和34.97%,差异极显著(P<0.01);各处理组肉鸡的法氏囊皱裂较发达,淋巴小结排列紧密且规则,淋巴细胞数量较多;淋巴细胞增殖试验显示,20日龄时,各试验组肉鸡的法氏囊淋巴细胞增殖活力极显著高于对照(P<0.01)。结果表明中草药和益生菌复方制剂能够显著促进肉鸡法氏囊的发育,增强机体的免疫功能。

山东省规模化猪场PRRSV NSP2变异株的感染情况调查

为了解山东省规模化猪场猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)NSP2变异株的感染情况,2010～2011年本研究从山东省未免猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)疫苗猪场、免疫进口PRRS弱毒苗猪场和免疫国产PRRS弱毒苗猪场选择20个临床表观健康的规模化猪场,采集830份血清,利用RT-PCR方法对其进行PRRSVNSP2变异株病原学检测。结果表明山东省规模化猪场普遍存在PRRSV NSP2变异株感染,而且临床表观健康的未免疫PRRS疫苗猪场、免疫进口PRRS弱毒苗猪场及免疫国产PRRS弱毒苗猪场中PRRSV NSP2变异株的检出率由高到低,同一猪群中存在PRRSV NSP2变异株野毒和疫苗毒。

鸡抗猪产肠毒素大肠埃希菌-沙门菌二联五价卵黄抗体的变化规律及喷干工艺的研究

为获得具有一定保护力的外源性抗体制剂,用于防治仔猪腹泻,利用产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)标准菌株K88、K99、987P和导致仔猪副伤寒的2株沙门菌,制备产毒素大肠埃希菌-沙门菌二联五价的灭活苗,免疫接种待开产母鸡400羽,聚乙二醇沉淀法分离纯化卵黄抗体,然后采用直接试管凝集法检测不同时间的卵黄抗体(IgY)效价。将试验结束后无菌收集的全蛋液稀释过滤后,按照喷干设备进口温度165℃,出口温度85℃进行喷雾干燥,制备卵黄抗体粉,并对其进行表观性状及相关指标的测定。结果表明,免疫接种蛋鸡后,卵黄液中抗体IgY的效价呈现规律性变化,喷雾干燥获得的卵黄抗体粉表观性状较好,粗蛋白含量为12.6%,体外消化率高达95%,IgY的效价为1∶29。通过3次免疫接种获得了高免卵黄抗体,并进行了全蛋喷雾干燥工艺的摸索,制备出了效价较高的抗体制剂,为预防和治疗仔猪腹泻提供了一条途径。

产朊假丝酵母菌发酵降解棉酚的效果

棉粕经高温高压处理后,利用产阮假丝酵母对棉粕进行固体发酵脱毒,通过对生物量的测定,获得最适发酵脱毒条件,然后进行发酵降解棉酚实验,通过测定发酵终点和起始点棉酚的含量,获得产朊假丝酵母对棉酚的降解率。结果显示最适发酵条件为:发酵底物含水量为37%,发酵时间48h,发酵温度30℃,接种量为5%。对发酵前和发酵48h后的样品按照国家标准测定方法进行棉酚含量的测定,结果显示棉粕在发酵前后,棉酚去除率在85.7%左右。

猪产毒素大肠杆菌K88黏附素FaeG基因重组乳酸菌对小鼠免疫性能的影响

目的为获得临床对猪大肠杆菌病较好的预防方法,研究猪产毒素大肠杆菌K88黏附素FaeG基因的重组乳酸菌对小鼠免疫性能的影响。方法将重组乳酸菌经口服(灌胃)免疫BALB/C小鼠,加强免疫后7 d处理小鼠,采集血液、脾脏、粪便,处理后采用试剂盒及间接ELISA方法,检查小鼠免疫性能变化情况。结果重组乳酸菌经口服免疫小鼠后,提高了小鼠生长初期的脾脏指数及细胞因子(IL-2)的含量,加强免疫后粪便中的sIgA与对照组相比,差异极显著(P<0.01),血清中猪ETEC(K88)的特异性抗体水平高于对照组,差异性达到了统计学上的显著水平(P<0.05)。结论含有猪ETEC K88黏附素FaeG基因的重组乳酸菌,可以诱导小鼠产生良好的针对猪产毒素大肠杆菌的全身体液和黏膜免疫应答。

动物肠道益生菌抗病毒作用机理的研究

动物肠道益生菌在提高机体免疫力,抑制病原微生物生长,维持肠道微生态平衡,改善机体代谢等方面起着重要作用。随着人们对益生菌的研究不断深入,益生菌的抗病毒功能逐渐被人们所认识,益生菌抗病毒作用机理研究也成为研究的热点。本文对动物肠道益生菌的抗病毒作用机理进行总结概括。

鸡α干扰素基因的人工合成、表达及抗病毒活性研究

为了获得具有抗禽源病毒活性的鸡α干扰素,对Genebank中发表的鸡源α干扰素基因进行密码子优化后,人工合成α干扰素基因片段489 bp,构建了表达载体PET-28a-IFN-α,连接转化到大肠杆菌菌株中,经PCR、酶切和测序鉴定后,诱导产生干扰素包涵体蛋白,破碎、纯化、透析复性、冻干浓缩后测定蛋白浓度,按禽流感H9EID50的浓度分别与不同剂量干扰素等量混合,接种鸡胚0.2μL,收集病毒,测定血凝价。结果显示:成功构建了原核表达载体pET-IFN-α,复性后蛋白浓度为472μg/mL,试验组(47.2μg和23.6μg)的血凝价与生理盐水对照组比较,差异极显著(P<0.01)。表明重组干扰素蛋白在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9禽流感病毒的效果,为下一步抗病毒制品的研发奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的克隆表达及其生物学特性的初步研究

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的生物学特性,根据Gen Bank上登录的PRRSV的基因序列设计引物,以生物研究院保存的PRRSV病料的总RNA为模板进行RT-PCR,获得N基因的完整开放阅读框为372bp,构建原核表达载体p ET-28a-N并转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达得到重组蛋白包涵体,经破碎、纯化、透析复性后通过SDS-PAGE电泳检测和Western blot分析表达产物的特性。结果显示,获得的重组蛋白大小约为21KD,能与抗PRRSV N蛋白的多抗发生特异性反应,说明该蛋白具有良好的免疫原性。BCA法测定蛋白浓度为540μg/m L,说明蛋白表达量较高。因此,试验重组蛋白表达量较高,且具有良好的免疫原性。

猪产肠毒素大肠杆菌多重PCR快速检测试剂盒的研制及应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的产肠毒素大肠杆菌检测方法,根据产肠毒素大肠杆菌LT、ST1、ST2保守基因序列分别设计合成了1对引物,建立了快速检测产肠毒素大肠杆菌的多重PCR方法,并对反应条件进行优化,组装成快速检测试剂盒。特异性检验表明参考菌株均可扩增出LT(282 bp)或ST1(183 bp)或ST2(360bp)的特异性条带,而非大肠杆菌均未扩增出任何条带。检测灵敏度达66 CFU,而且稳定性良好,保质期可达12个月以上。通过对临床样品的检测,证实该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点。

中药在vero细胞上的最大安全浓度测定方法的比较

为了测定黄芪、板蓝根、甘草、黄芩、败酱草在vero细胞上的最大安全浓度,将各中药两倍比稀释加入到长满单层的vero细胞板上,通过比较形态学观察法和MTT法,测定各中药在vero细胞上的最大安全浓度。结果显示,黄芪、板蓝根、甘草、黄芩、败酱草通过形态学观察法测得的最大安全浓度分别为78.25、35、12.5、4.688、5.23 mg/mL;MTT法测定的最大安全浓度分别为39.13、35、6.25、0.59、2.62 mg/mL。其中黄芪对细胞的毒性最低,黄芩对细胞的毒性最高。通过MTT法测得最大安全浓度比形态学观察法大约要低,说明MTT法比形态学观察法更加灵敏。

母猪子宫黏膜免疫对繁殖性能与健康影响的研究

为探讨子宫黏膜免疫方式(子宫灌注"安宫1号")对母猪繁殖性能与健康的影响,选择妊娠后期长白经产母猪38头,按随机区组法分成对照组和"安宫1号"组,每组19头。对照组母猪按猪场常规方式进行管理;试验组母猪分娩产完胎衣后,子宫灌注"安宫1号"100 mL,连续进行2个繁殖周期的试验,跟踪测评各组母猪和哺乳仔猪的生产性能和健康状况。结果表明:1)连续2次繁殖的试验期内,与对照组相比,安宫1号组母猪的产仔数、产活仔数、仔猪初生重无显著差异(P>0.05),但第2次繁殖的试验组仔猪25 d断奶个体重和哺乳期日增重分别提高16.59%(P<0.05)和20.38%(P<0.05)。2)安宫1号组母猪与对照组相比,断奶后7 d内发情率分别提高5.27和5.43个百分点,平均断奶发情间隔分别缩短1.35 d和4.82 d;第2次繁殖中,安宫1号组母猪情期受胎率和总受胎率分别提高10.0和13.12个百分点;连续2次繁殖试验期间,安宫1号组母猪的被动淘汰率降低21.05个百分点。3)与对照组相比,安宫1号组母猪抗氧化性能和免疫机能不同程度提高,其中,血清总抗氧化能力提高29.66%(P<0.05),丙二醛含量降低27.94%(P<0.05),血清IgG、IgA和总蛋白、白蛋白分别提高23.06%、14.39%和8.86%、9.92%,均差异显著(P<0.05);安宫1号组母猪断奶后血清促黄体素、促卵泡素和雌二醇水平有不同程度提高、孕酮水平则显著降低。研究证明,分娩后子宫灌注"安宫1号",能够改善母猪的免疫机能和生殖内分泌机能,提高母猪健康和持续繁殖性能,并间接改善哺乳仔猪的生长性能。

动物肠道益生菌抗病毒作用机理的研究

动物肠道益生菌在提高机体免疫力,抑制病原微生物的生长,维持肠道微生态平衡,改善机体代谢等方面起着重要作用。随着人们对益生菌的研究不断深入,益生菌的抗病毒功能逐渐被人们所认识,益生菌抗病毒作用机理的研究也成为研究的热点。文章对动物肠道益生菌的抗病毒作用机理进行总结概括。