钙结合蛋白S100A4对BCG感染THP-1细胞自噬的调控作用

本研究旨在探究牛结核分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核巨噬细胞THP-1后,钙结合蛋白S100A4对细胞自噬的调控作用。以感染复数为10∶1的BCG感染THP-1细胞不同时间,用Western blot检测S100A4和LC3Ⅱ的表达,以确定最佳感染时间,并采用透射电镜观察自噬体数量变化。在BCG单独感染或与S100A4小干扰RNA共处理THP-1细胞12 h后,采用qRT-PCR检测S100A4及自噬相关因子--微管相关蛋白轻链3II (microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白7(autophagy-related gene 7, Atg7)、Beclin-1在mRNA水平上的表达,采用Western blot检测S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在蛋白水平的表达。利用mRFP-GFP-LC3检测自噬流,激光共聚焦显微镜观察细胞中mRFP-LC3和mRFP-GFP-LC3点状聚集。结果显示:在BCG感染THP-1细胞不同时间后,S100A4和LC3Ⅱ在蛋白表达水平随感染时间的延长先上升后下降,在12 h时表达最高(P<0.001),且自噬体数量明显增多。在mRNA水平上,与siNC组相比,siNC+BCG感染组S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的mRNA表达水平显著上调(P<0.05),当BCG和siS100A4共处理后,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在mRNA水平的表达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,P<0.001)下调;在蛋白水平上,与未感染组相比,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的蛋白表达量显著增多(P<0.05),BCG和siS100A4共处理后,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的蛋白表达量均极显著减少(P<0.001);与未感染组相比,BCG组自噬体的数量极显著增多(P<0.01),siS100A4+BCG组与siNC+BCG组相比,自噬体的数量显著减少(P<0.05)。S100A4对BCG感染巨噬细胞诱导的自噬具有调控作用,S100A4能够促进BCG诱导的THP-1细胞自噬。

敲低Wnt7a抑制卡介苗诱导的小鼠肺泡上皮细胞自噬

目的探究无翅基因7a(Wnt7a)对牛结核分枝杆菌卡介苗(BCG)感染的肺泡上皮细胞自噬水平的调控作用。方法使用干扰Wnt7a慢病毒及BCG单独作用或共处理TC-1小鼠肺泡上皮细胞,设置小干涉RNA对照(si-NC)组、si-NC联合BCG组、Wnt7a小干涉RNA(si-Wnt7a)组和si-Wnt7a联合BCG组。Western blot法检测Wnt7a、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62及自噬相关基因5(ATG5)蛋白表达水平,利用免疫荧光细胞化学染色检测LC3的分布以确定细胞自噬情况。结果与si-NC组相比,BCG感染的TC-1细胞Wnt7a、LC3和ATG5蛋白表达均升高、LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著增加;与BCG组感染的TC-1细胞相比,si-Wnt7a联合BCG组Wnt7a、LC3、P62及ATG5蛋白表达均显著降低,LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著降低。结论敲低Wnt7a抑制BCG诱导的肺泡上皮细胞自噬。

BCG感染对小鼠肺组织中NLRP3炎性小体相关分子表达的影响

探究牛分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染C57BL雌性小鼠后,小鼠肺组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎性小体相关分子的表达水平.设置BCG感染组和对照组,BCG感染组小鼠经气管滴注BCG菌液,对照组小鼠经气管滴注PBS缓冲溶液.BCG感染28 d后处死小鼠并摘取肺组织.经HE染色法观察并鉴定小鼠肺组织的损伤程度,通过Western blot和qRT-PCR实验检测NLRP3炎性小体相关分子的表达水平.结果表明,BCG感染后,小鼠肺组织发生炎性细胞浸润,NLRP3,ASC,Caspase-1,Caspase-11蛋白及mRNA表达量上调,表现出极显著差异(P<0.01).表明BCG感染后,小鼠肺组织发生炎性病变,并上调NLRP3炎性小体相关分子的表达水平.

BCG感染巨噬细胞后内质网应激对细胞焦亡的调控作用

旨在探讨牛分枝杆菌疫苗株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核巨噬细胞THP-1细胞后内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)对细胞焦亡的调控作用及分子机制。在BCG单独感染THP-1细胞或与ERS抑制剂TUDCA共处理细胞后,采用qRT-PCR检测ERS标志性分子GRP78,细胞焦亡标志性分子GSDMD、Caspase1、NLRP3、IL^(-1)β和IL^(-1)8在mRNA水平的表达,采用Western blot检测GRP78、Caspase12、GSDMD、Caspase1和NLRP3在蛋白水平的表达,采用ELISA检测IL^(-1)β和IL^(-1)8的释放量,采用CCK-8检测细胞存活率。结果表明:在BCG单独感染THP-1细胞不同时间后,GRP78在mRNA水平和蛋白水平的表达均随感染时间延长而升高(P<0.01),GSDMD蛋白表达在24 h达到最高,IL^(-1)β和IL^(-1)8在mRNA水平的表达呈时间依赖性(P<0.01)。在BCG单独感染或与TUDCA共同作用细胞24 h后,与未感染对照组相比,BCG感染组GRP78、GSDMD、Caspase1、NLRP3、IL^(-1)β和IL^(-1)8 mRNA水平表达上调(P<0.05),GRP78、Caspase12、GSDMD、Caspase1和NLRP3蛋白水平表达上调(P<0.001),IL^(-1)β和IL^(-1)8的浓度增加(P<0.01),细胞存活率下降(P<0.001),而经TUDCA预处理的BCG感染组与BCG单独感染组相比,以上分子的表达下降,细胞存活率上升(P<0.01)。综上表明,在BCG感染THP-1细胞后,引起的ERS对细胞焦亡具有调控作用。

PERK/ATF4/CHOP通路对BCG诱导THP-1细胞NLRP3炎性小体活化的调控作用

旨在探讨牛分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核巨噬细胞THP-1细胞后PERK/ATF4/CHOP通路对NLRP3炎性小体的调控作用。在BCG单独感染或与PERK小干扰RNA共处理THP-1细胞后,采用qRT-PCR和Western blot方法检测NLRP3炎性小体相关分子和PERK/ATF4/CHOP通路标志性分子在mRNA、蛋白水平的表达;在BCG单独感染或与PERK抑制剂GSK2656157共处理THP-1细胞后,分别采用qRT-PCR和Western blot方法检测NLRP3炎性小体相关分子和PERK/ATF4/CHOP通路标志性分子在mRNA、蛋白水平的表达,采用ELISA方法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的释放量,采用CCK-8方法检测THP-1细胞活率,采用免疫荧光检测NLRP3与ASC的共定位。结果表明:在BCG单独感染THP-1细胞不同时间后,PERK、NLRP3、ASC和Caspase-1在蛋白水平的表达均随感染时间延长而升高,且在24 h达到最高(P<0.001),IL-1β和IL-18的释放随时间递增,24 h达到最高(P<0.001)。在BCG单独感染或与PERK小干扰RNA共处理THP-1细胞24 h后,与未感染对照组相比,siNC+BCG感染组NLRP3、ASC、Caspase-1、PERK、ATF4、CHOP分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著(P<0.001)上调,而siPERK+BCG感染组与siNC+BCG感染组相比,NLRP3等关键分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著下调(P<0.01,P<0.001);在BCG单独感染或与GSK2656157共同作用THP-1细胞24 h后,与未感染对照组相比,BCG感染组NLRP3、ASC、Caspase-1、PERK、ATF4、CHOP分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调,IL-1β和IL-18的释放极显著增加(P<0.001),细胞活率极显著下调(P<0.001),而BCG+GSK2656157感染组与BCG单独感染组相比,上述分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著下调(P<0.01),IL-1β和IL-18的释放显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)减少,细胞活率显著上调(P<0.05),免疫荧光的结果显示NLRP3与ASC存在共定位,且GSK2656157可以极显著抑制BCG感染引起的NLRP3和ASC的表达上调(P<0.001)。以上研究结果表明,PERK/ATF4/CHOP通路对BCG感染巨噬细胞后NLRP3炎性小体的活化具有调控作用。

敲低受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)抑制卡介苗诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞自噬

目的探讨Wnt5a/受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)信号通路对卡介苗(BCG)感染引起的巨噬细胞自噬的调控作用。方法采用BCG感染RAW264.7小鼠巨噬细胞0、2、6、12、24 h,Western blot法检测Wnt5a、ROR2及自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)的表达。在敲低ROR2表达和BCG感染分别作用或共同处理RAW264.7细胞后,采用Western blot法检测RAW264.7细胞自噬相关基因5(ATG5)、P62、beclin-1、ATG7、LC3Ⅱ的蛋白表达,采用表达单体红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白和LC3的(mRFP-GFP-LC3)自噬双标腺病毒法检测细胞自噬流。结果与未感染对照组相比,BCG感染RAW264.7细胞6 h后,Wnt5a、ROR2、LC3Ⅱ的表达最高。与未感染对照组相比,BCG感染组自噬相关蛋白ATG5、P62、beclin-1、ATG7、LC3Ⅱ的表达上调,自噬体和自噬溶酶体数量增加;与BCG感染组相比,敲低ROR2并经BCG感染后,上述蛋白的表达下调,自噬体和自噬溶酶体数量减少。结论BCG感染小鼠巨噬细胞激活自噬,而敲低ROR2抑制BCG引起的细胞自噬。

ATF6/CHOP信号通路对减毒牛结核分枝杆菌感染的THP-1细胞焦亡的调控作用

目的:探讨转录激活因子6(ATF6)/CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)信号通路对牛分枝杆菌减毒株(卡介苗,BCG)感染的THP-1细胞焦亡的调控作用。方法:在感染复数为10∶1的BCG感染THP-1细胞2、6、12、24和48 h基础上,设置si-NC组、si-NC+BCG组、si-ATF6+BCG组及si-CHOP+BCG组。si-NC组转染干扰阴性对照24 h后正常培养;si-NC+BCG组先转染阴性对照24 h后以感染复数为10∶1的BCG感染24 h;si-ATF6+BCG组和si-CHOP+BCG组分别转染si-ATF6和si-CHOP 24 h后再用感染复数为10∶1的BCG感染24 h。采用Western blot检测cleaved ATF6、CHOP、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、pro-caspase-1、caspase-1 p20、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、IL-1βp17、IL-18 p22及消皮素D-N端片段(GSDMD-N)蛋白表达;采用免疫荧光检测GSDMD蛋白表达;采用CCK-8法检测细胞活力。结果:Western blot结果显示,BCG感染THP-1细胞后,cleaved ATF6和CHOP蛋白的表达随感染时间延长逐渐升高,48 h达到最高,而GSDMD-N蛋白在24 h表达最高(P<0.01)。与si-NC组相比,si-NC+BCG组的cleaved ATF6、CHOP、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1 p20、ASC、IL-1βp17、IL-18 p22及GSDMD-N蛋白表达显著上调(P<0.01),细胞内GSDMD含量显著增加(P<0.01),细胞活力显著下降(P<0.01);与si-NC+BCG组相比,si-ATF6+BCG组上述蛋白表达显著下调(P<0.01),细胞内GSDMD含量显著下降(P<0.01),细胞活力显著上升(P<0.01);与si-NC+BCG组相比,si-CHOP+BCG组上述蛋白表达显著下调(P<0.01),细胞内GSDMD含量显著下降(P<0.01),细胞活力显著上升(P<0.01)。结论:ATF6/CHOP信号通路对BCG感染的THP-1细胞焦亡具有调控作用。

干扰Wnt5a对BCG诱导的TC-1细胞炎性反应的调控作用研究

目的探究干扰Wnt5a对卡介苗(BCG)感染的小鼠肺上皮细胞(TC-1)炎性反应的调控作用,并阐明其作用机制。方法慢病毒干扰Wnt5a处理TC-1细胞系及其阴性对照细胞系后BCG感染24h。设置4个实验组:NC组、NC+BCG组、Si-3组和Si-3+BCG组。通过Western blot检测Toll样信号通路TLR2、TLR4、Myd88、p-NF-κB和NF-κB炎症相关蛋白表达水平,免疫荧光法检测各实验组p-NF-κB表达情况,qRT-PCR检测Toll样信号通路TLR2、TLR4、Myd88、p-NF-κB和NF-κB等基因mRNA表达水平,ELISA检测细胞培养上清促炎因子TNF-α、IL-6和IL-10含量。结果与对照组比较,BCG组炎性相关因子TLR2、TLR4、Myd88、NF-κB、p-NF-κB的蛋白表达水平(均P<0.01)和mRNA表达水平均显著上调(均P<0.05),p-NF-κB蛋白荧光强度较对照组显著增加,促炎因子TNF-α和IL-6表达水平升高(均P<0.01),抑炎因子IL-10表达水平降低。与BCG组相比,Si-3+BCG组上述蛋白表达水平(均P<0.05)和mRNA表达水平均(均P<0.01)显著下调,p-NF-κB蛋白荧光强度较BCG组均显著下调,促炎因子TNF-α和IL-6(均P<0.05)表达水平显著降低,抑炎因子IL-10表达水平显著升高(P<0.01)。结论干扰Wnt5a可调控卡介苗(BCG)感染的小鼠肺上皮细胞(TC-1)的炎性反应,其调控作用机制是通过Toll样信号通路依赖Myd88途径抑制BCG诱导的TC-1炎性反应。

内质网应激对结核分枝杆菌诱导细胞凋亡的调控作用

在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)与吞噬细胞相互作用的过程中,细胞凋亡是重要的生物学过程,决定着Mtb的命运。由内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介导的细胞凋亡在抗Mtb感染中发挥着重要作用,已成为结核病发病机制研究中的热点问题。本文综述了ERS对Mtb诱导细胞凋亡中的调控作用,这将为深入研究结核菌与宿主细胞互作的分子机制提供重要理论依据。

Wnt5a调节BCG感染肺泡上皮细胞自噬的作用研究

目的探讨Wnt5a在卡介苗(BCG)感染肺泡上皮细胞后对细胞自噬的调控作用。方法用BCG感染小鼠肺泡上皮细胞TC-1,分别收集感染不同时间(MOI=10)、不同浓度rhWnt5a及IWP_(2)处理的TC-1细胞,利用Western blot检测Wnt5a及自噬相关蛋白LC3蛋白表达水平,确定TC-1细胞自噬的最佳时间以及rhWnt5a和IWP_(2)最适浓度;利用rhWnt5a或IWP_(2)与BCG单独或共处理TC-1,其中rhWnt5a处理试验设对照组(Control)、BCG组、rhWnt5a组和rhWnt5a+BCG组,IWP_(2)处理试验设对照组(Control)、BCG组、IWP_(2)组和IWP_(2)+BCG组,Western blot检测细胞Wnt5a、LC3和P62蛋白表达水平,免疫荧光染色检测LC3B绿色斑点分布,以确定各处理组细胞自噬情况。结果 Western blot检测在4 h时BCG诱导的TC-1细胞Wnt5a及LC3II表达水平均高于其他时间组,rhWnt5a上样为10 ng/mL时Wnt5a表达水平较Control组显著增加(P<0.01),IWP_(2)上样为20μmol/L时Wnt5a表达水平较Control组显著降低(P<0.01),在不同处理组中,rhWnt5a+BCG组较BCG组Wnt5a、LC3II及P62的表达均显著升高(均P<0.01),IWP_(2)+BCG组较BCG组处理Wnt5a、LC3II及P62的表达均显著降低(均P<0.01),且较Control组均升高(均P<0.05)。免疫荧光染色显示,BCG感染后TC-1细胞中的LC3B斑点数量与荧光强度较Control组均显著增加,BCG与rhWnt5a共处理后细胞中LC3B斑点数量与荧光强度较BCG组均显著增多,BCG与IWP_(2)共处理后LC3B斑点数量与荧光强度较BCG组均显著减少(均P<0.05)。结论 Wnt5a对BCG诱导的TC-1细胞自噬具有调控作用。rhWnt5a重组蛋白能促进BCG诱导的TC-1细胞自噬,IWP_(2)对BCG诱导的TC-1细胞自噬有抑制作用。