猪流感病毒的演化

猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是感染猪的一种。呼吸道病毒,可对公共卫生产生重要影响。以往研究通过全基因组测序以及分子生物学、流行病学等多方面的手段,全面揭示了SIV的演化进程。为了更好地理解和应对SIV演化,对其演化历程进行了简要回顾,系统梳理了其分类、基本特征、演化及流行。通过对SIV演化的深入分析,发现其基因变异频率较高,不断发生基因重配和突变,推动病毒不断演化。此外,在猪群中发现了多种亚型SIV,而且不同地区的SIV演化存在显著差异,其中一些地区的SIV可能存在感染人的潜在风险。总体而言,SIV演化是一个复杂而动态的过程,其演化趋势可能对人类和动物健康构成潜在威胁。因此,加强对SIV演化的研究,提高对其监测和控制的能力,对于维护畜牧业健康发展和公共卫生安全具有极为重要的意义。

影响猪流感病毒致病性和传播性的关键氨基酸位点的研究进展

猪流感病毒(SIV)在猪群中广泛传播,给养猪业造成重大的经济影响。流感病毒主要是通过病毒基因组的突变和不同来源流感病毒基因组的重新组合来完成自身的进化。通过以上两种方式产生的流感病毒对动物的致病性和传播性会出现显著改变。在这篇综述中,我们对影响SIV致病性和传播性的关键氨基酸位点的突变进行了归纳和分析,为进一步研究SIV的致病机制等方面奠定了基础。

用套式RT-PCR技术检测石蜡包埋组织中的猪瘟病毒RNA

利用套式反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,对实验性感染猪瘟病毒猪的福尔马林固定石蜡包埋组织标本中的病毒RNA进行检测,将所扩增产物点样于尼龙膜上进行Dot-blotting鉴定,扩增结果与各器官的病理组织学变化进行了比较。从攻毒对照组猪的肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结和扁桃体中检出了猪瘟病毒RNA,未从免疫攻毒猪只的脏器中检出猪瘟病毒RNA;所有扩增产物经Dot-blotting鉴定均得到了阳性信号;病毒基因的检出率与猪瘟病毒导致的病理组织学变化程度相一致。本试验成功建立了套式RT-PCR技术检测石蜡包埋组织中的猪瘟病毒RNA方法,为猪瘟病毒的诊断和回顾性分析提供了技术手段。

猪MHC-Ⅰ α生物素化序列融合基因的构建、表达与纯化

采用RT-PCR技术从猪外周血单核细胞(PBMC)中获得猪白细胞抗原基因座P1、P14等位基因的胞外区,并在其3′端拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP),构建了pET-P1-BSP和pET-P14-BSP高效表达载体并进行诱导表达和纯化,用SDS-PAGE和Western blotting法对表达产物进行鉴定。结果显示,成功构建了融合表达载体pET-P1-BSP和pET-P14-BSP,表达产物以包涵体的形式存在,获得高纯度的P1-BSP和P14-BSP蛋白,为进一步利用亲和素在体外构建SLA-I类分子肽四聚体奠定了基础。

2016～2017年山东省三种亚型猪流感血清学调查

猪流感是一种人畜共患传染病,猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)在全世界各国的猪群中普遍存在。为了解山东省猪群中SIV的感染情况,2016年6月至2017年12月在山东省各地共采集7000份血清,采用HI抗体检测方法,分别用类禽型猪H1N1(EA H1N1)、2009甲型H1N1(2009/H1N1)和H3N2亚型抗原为标准抗原进行检测。结果显示,SIV抗体总阳性率为63.79%,其中EA H1N1抗体阳性率为56.31%,2009/H1N1抗体阳性率为24.61%,H3N2亚型抗体阳性率为1.61%。本研究结果表明2016~2017年山东省SIV感染比较普遍,类禽型猪H1N1抗体阳性率最高,2009甲型H1N1,H3N2抗体阳性率较低。

果子狸SARS-CoV实验性感染的病理学研究

目的为了明确实验性感染SARS-CoV的果子狸各器官的病理变化,进一步确定SARS-CoV与果子狸的关系,评价其作为SARS动物模型的可行性。方法在人源SARS-CoV分离株BJ01(有29个核苷酸的缺失序列)和GD01(无29个核苷酸的缺失序列)实验性感染果子狸的基础上,对其经福尔马林固定的肺、脾、淋巴结、肝、小肠、肾、气管、大脑、胰腺、性腺、胃、心组织进行病理组织学观察,同时用原位杂交技术(ISH)对SARS-CoV在组织器官中的分布进行检测。结果攻毒后不同时期,肺、脾、淋巴结、肝、小肠、肾和大脑有不同程度的病理变化,主要病变是肺脏为急性间质性肺炎:肺炎性水肿、肺泡腔浆液渗出以及肺泡壁充血、出血并因淋巴细胞、巨噬细胞增生、浆液渗出而显著增厚,肺内小血管增生、扩张。淋巴结、脾脏结构破坏,淋巴滤泡消失,脾小体萎缩,淋巴细胞明显减少,结缔组织增生。肝细胞脂肪变性,并见有多个淋巴细胞浸润灶。ISH结果显示,在肺、小肠、大脑中检测到SARS-CoV基因,其它器官中未检到,与SARS患者的检测结果基本相符。结论果子狸实验性感染SARS-CoV可导致与人类相似的病理学变化和病原分布,表明果子狸可以作为评价SARS-CoV疫苗及治疗药物的动物模型。

水溶性甲壳胺体外抑菌活性的试验研究

用二倍稀释法测定 6种甲壳胺样品的最低抑菌浓度 (MIC) ,并根据MIC制作含有甲壳胺的普通琼脂培养基和药敏试纸片。结果表明 :编号为 1 #、 3 #、 4 #、 6 #甲壳胺在一定浓度时对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、巴氏杆菌均有不同的抑制作用 ;2 #、 5 #在试验所用浓度下抑菌效果不明显。用与MIC相同浓度配制的甲壳胺琼脂的抑菌作用与试管MIC法相同 ,而甲壳胺试纸片则需要 8个MIC才有抑菌作用。

原位杂交组织化学技术中信号扩增的研究进展

原位杂交组织化学(ISHH)技术是利用两条互补单链之间通过核酸分子碱基的氢键配对反应形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组织化学方法,在核酸原有的位置上把它显示出来。目前它已是一种比较成熟的技术,因其能对核酸进行原位检测而得到广泛的应用。ISHH的种类很多,其方法的改进主要在于检测信号提高上目前用于信号扩增的方法主要有原位PCR侧链系统、酪胺信号放大、催化报告分子沉淀、尾探针原位杂交和原位引物延伸标记这些方法的建立,不同程度的提高了信噪比使ISSH的灵敏性增加并得到广泛的应用。

Marc-145细胞CD151蛋白主要抗原表位区的表达及其与猪繁殖与呼吸综合征病毒感染关系的研究

为研究CD151与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的关系,根据GenBank中已发表的CD151蛋白的基因序列设计并合成一对特异性引物,从Marc-145细胞中扩增出294bp的CD151基因片段并克隆入pGEX4T-3载体,转化入大肠杆菌用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。表达蛋白纯化后用于免疫小鼠制备抗CD151蛋白血清,用ELISA和IFA检测抗血清的效价及特异性。将抗CD151蛋白血清与Marc-145细胞孵育后再感染PRRSV,观察细胞CPE验证该血清对PRRSV的阻断效果。结果表明成功构建了pGEX4T-3-CD151,获得了相对分子质量为37ku的重组CD151蛋白。制备的抗血清特异性结合Marc-145细胞并有效阻断PRRSV感染Marc-145细胞。这些研究结果为进一步阐明CD151与PRRSV感染的关系提供一定的理论基础。

鸡感染J亚群禽白血病病毒的免疫抑制机理

通过人工接种建立了雏鸡感染J亚群禽白血病病毒(ALV-J)后发生免疫抑制的病理模型,对免疫抑制的机理进行了初步研究。结果表明:ALV-J感染早期可诱导胸腺、法氏囊的淋巴细胞凋亡,这种早期的淋巴细胞凋亡是胸腺和法氏囊萎缩的重要原因之一。病理组织学动态观察表明,ALV-J主要引起骨髓的髓系细胞灶状或弥漫性增生,病变导致骨髓机能受损,使机体免疫机能下降,是引起免疫抑制的根本原因。病毒感染组免疫器官均发生了严重的实质萎缩性病变,这种病变的发生除与骨髓的病变及淋巴细胞凋亡有关外,还与中后期淋巴细胞的坏死有关,从而导致严重的免疫抑制。ALV-J感染可引起免疫器官及部分内脏器官中嗜酸性粒细胞样的瘤细胞浸润增生,这可以作为病毒感染早期的病理诊断指标。

鸡γ-干扰素实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测鸡γ干扰素的实时荧光定量RT-PCR方法,采用RT-PCR方法从ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的总RNA中扩增得到鸡γ干扰素（ChIFN-γ）和鸡的28 S rRNA（Ch28 S）基因,将其分别克隆至体外转录载体后经体外转录获得了ChIFN-γ和Ch28 S的RNA,采用各自的特异性引物及Taqman探针,以Ch28 S RNA作为内参进行一步法实时荧光定量RT-PCR,检测ChIFN-γ.结果表明：ChIFN-γ和内参Ch28 S的Ct值与标准品稀释梯度在1×102～1×107拷贝/μL范围分别呈良好的线性关系,γ2均大于0.99.此方法用于检测ChIFN-γ,具有简便、高效、敏感、特异的特点.

马γ-干扰素成熟蛋白基因在大肠埃希氏菌中表达及其多克隆抗体制备

采用RT-PCR从ConA刺激的马外周血单核细胞(PBMC)中扩增获得含信号肽的马γ-干扰素(Equine interferon-γ,EIFN-γ)基因,将其克隆至载体pCR2.1-TOPO中。通过PCR方法从重组质粒(pCR-EIFN-γ)中扩增马干扰素成熟蛋白(Mature EIFN-γ,reEIFN-γ)基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)。重组子经测序鉴定正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,将纯化后的表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。结果表明,mEIFN-γ基因全长为441bD,含一个开放阅读框,编码146个氨基酸的成熟蛋白;对其表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,重组蛋白相对分子量约为18Ku,且具有免疫反应活性。mEIFN-γ基因在大肠杆菌中高效表达并在非变性和变性条件下,采用Ni^+亲和层析纯化方法均可获得高纯度的重组马γ-干扰素制备的多克隆抗体,为建立马γ-干扰素检测方法、监测机体免疫状态和研究机体免疫机制奠定了基础。

蛋鸡网状内皮组织增生病病毒分离鉴定

山东某鸡场饲养的10000只父母代海兰蛋种鸡于育成前期出现进行性消瘦、生长发育不良等症状;剖检以腺胃肿胀、淋巴器官萎缩为特征,至70日龄发病率达90%;经ELISA方法检测抗体及间接免疫荧光原位病原检测证明该病与网状内皮组织增殖病病毒(REV)感染有关。取7只病鸡肝脏研磨处理后接种鸡胚成纤维细胞(CEF),用REV单抗11B118进行间接免疫荧光检测,结果均呈阳性;根据REV-HA株前病毒基因组DNA env囊膜糖蛋白基因序列设计引物,提取阳性CEF基因组DNA作为模版,PCR扩增后得到438 bp的目的片段;PCR产物测序结果比对显示,该毒株与其他中国野毒株的同源性高于与REV-HA株的同源性。综合诊断判定该病可能与鸡群早期感染致病力较强的REV有关。

猪支原体肺炎弱毒活疫苗与灭活疫苗联合免疫的免疫效果评估

为研究猪支原体肺炎(MPS)弱毒活疫苗与灭活疫苗联合免疫的免疫效果,本研究选取40头10日龄猪肺炎支原体(Mph)阴性仔猪,随机平均分为4组。A组肌肉注射灭活疫苗;B组喷鼻弱毒活疫苗;C组肌注灭活疫苗同时喷鼻弱毒活疫苗;D组为空白对照。疫苗免疫后每天观察猪群的整体状态,于免疫后3 d、30 d、90 d、180 d,分别采集鼻腔棉拭子和血液样品,进行应激相关指标以及相关疾病的抗体检测,并于免疫后180 d进行MPS病原检测。仔猪屠宰时称重,采集其完整肺脏,计算其平均增重并进行肺脏病变评分。结果显示:C组猪生长状况最好,猪群支原体感染率低、抗体水平高、平均增重高并且肺脏病变程度低,表明采用MPS灭活疫苗和弱毒活疫苗联合的免疫效果更好,并且未引起严重的应激反应。本研究对MPS疫苗的合理应用提供了实验依据。