反相高效液相色谱法分析聚乙二醇修饰的水蛭素

目的:采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对聚乙二醇(PEG)修饰的水蛭素进行分析分离,用以分析修饰产物中不同修饰度水蛭素的组成和比例。方法:色谱柱为HypersilC18,5μm,4.6mm×150mm;流动相A为H2O+0.01%的三氟乙酸,流动相B为乙腈+0.01%的三氟乙酸。40min内由10%～50%流动相B进行梯度洗脱,洗脱流速1mL/min,上样量50μL,检测波长为214nm。结果:在单甲基化PEG-丙酸琥珀酰亚胺和水蛭素摩尔比不同的的反应产物中,PEG1-水蛭素、PEG2-水蛭素均可以达到基线分离,且不同批次的反应产物进行RP-HPLC的重复性良好。结论:RP-HPLC可以有效地对PEG修饰的水蛭素产物进行分析分离,为PEG化水蛭素的长效、缓释剂型的开发提供技术支持。

重组质粒pUDKH工程菌库的制备及检定

目的:pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。为了生产制备重组质粒pUDKH,须建立菌种库并对其进行质量检定。方法:将质粒pUDKH转化大肠杆菌DH5α,经筛选后制备成初始菌种库和工作菌种库,对菌种进行革兰染色、电镜、抗生素抗性、遗传稳定性、质粒拷贝数、生化反应等检定。结果与结论:菌种生产pUDKH的产量较高,无支原体及其他微生物污染,40代次内菌种性状、遗传稳定性、质粒拷贝数均稳定,可作为工艺生产用菌种。

RKIP介导的ERK通路在电磁辐射致海马神经元损伤中的作用

目的:研究电磁辐射对原代培养海马神经元Raf激酶抑制蛋白(RKIP)和磷酸化ERK表达的影响,应用MEK的抑制剂U0126探讨RKIP介导的ERK通路在辐射损伤中的作用。方法:体外培养原代海马神经元,采用X-HPM、S-HPM及EMP作为辐射源,分别建立3种电磁辐射细胞模型。通过免疫荧光标记、激光扫描共聚焦显微镜检测RKIP和磷酸化ERK的表达;利用AnnexinV-PI双标记、流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡与坏死率。结果:三种电磁辐射后海马神经元RKIP表达均减少,磷酸化ERK表达均增加,且胞核移位发生,辐射组间均未见明显差异;U0126预处理组较单纯辐射组神经元的凋亡与坏死率明显降低,但仍高于假辐射组。结论:RKIP介导的ERK通路过度激活是电磁辐射致海马神经元凋亡与坏死的重要机制之一,U0126对电磁辐射损伤具有一定防护作用。

MiR-486通过调控Sirt1调节TF-1细胞的糖代谢

目的:探索低氧条件下造血细胞miR-486表达变化及miR-486对造血细胞糖代谢的调控作用及机制。方法:利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法检测低氧条件下TF-1细胞miR-486及Sirt1的表达水平。用慢病毒技术将miR-486过表达或沉默后检测Sirt1、葡萄糖转运因子1(glucose transporter 1,Glut1)和葡萄糖转运因子4(glucose transporter 4,Glut4)的表达水平。另外,将Sirt1沉默后分别用qRT-PCR及Western blot检测Sirt1的表达,并用qRT-PCR检测Glut1和Glut4的表达水平。结果:低氧促进miR-486的表达并抑制Sirt1的表达;过表达miR-486导致Sirt1的表达下调,而沉默miR-486可以促进Sirt1的表达;过表达miR-486上调Glut1和Glut4的表达,而沉默miR-486则抑制Glut1和Glut4的表达;沉默Sirt1可以促进Glut1和Glut4的表达。结论:MiR-486可以通过影响Sirt1调节TF-1细胞的糖代谢。

土壤放线菌3423代谢产物的分离纯化及结构鉴定

目的对土壤来源的Streptomyces sp. 3423代谢产物中的抗肿瘤活性成分进行分离纯化和结构鉴定。方法采用MTT法,以对K562细胞的抑制活性为指标,筛选活性菌株。发酵培养液经各种色谱技术分离纯化,并通过对其理化性质、质谱、紫外、红外和核磁共振等图谱数据分析,确定化合物的结构。结果和结论Streptomyces sp. 3423代谢产物中分离得到6个哌嗪二酮类化合物。生物学活性研究发现化合物III和IV对K562细胞具有抑制活性,其中化合物IV活性最强,IC50为14.1μg/ml。

创伤合并γ射线照射后大鼠脾脏Treg/Th17平衡的变化及其意义

目的观察创伤大鼠经5Gyγ射线全身照射后伤口愈合情况及脾脏Treg/Th17平衡变化的特点,探讨两者之间的关系及意义。方法清洁级雌性Wistar大鼠65只,按体重随机分为正常对照组（正常组）、单纯创伤组（单伤组）和创伤＋5Gyγ射线全身照射组（伤照组）。分别于伤照后1、3、7、14、21、28d,检测各组大鼠伤口残留面积及外周血白细胞和淋巴细胞计数,并采用流式细胞仪测定脾脏Treg细胞和Th17细胞亚群的变化。结果伤照后7-21d伤照组伤口残留面积持续大于单伤组（P〈0.01）,21d时单伤组伤口已基本愈合,而伤照组延迟至28d才基本愈合。单伤组伤照后1～7d外周血白细胞及淋巴细胞计数均明显低于正常组（P〈0.05,P〈0.01）。伤照组1~14d时外周血白细胞及淋巴细胞计数均显著低于正常组和单伤组,21~28d时白细胞计数仍显著低于正常组和单伤组（P〈0.05,P〈0.01）。伤照组大鼠脾脏Treg细胞仅在伤照后3d和7d高于正常组和单伤组（P〈0.01）,而Th17细胞于伤照后1d即显著增高（P〈0.01）,3d时升至最高,至28d时才恢复至正常组和单伤组水平。伤照组1-21d时Treg/Th17比值均显著低于正常组和单伤组（P〈0.01）,至28d时恢复至正常组和单伤组水平。结论 5Gyγ射线全身照射可导致大鼠创伤愈合延迟,Treg/Th17平衡失调在其中可能发挥了重要作用。

CD147与子宫内膜异位症的相关性研究

目的 :探讨和比较免疫球蛋白超家族分子CD147在子宫内膜异位症患者异位子宫内膜、在位子宫内膜及健康人子宫内膜中表达及定位。方法 :采用免疫组化方法对 30例异位子宫内膜及其 18例同期在位子宫内膜和 15例健康人子宫内膜组织中的CD147的表达进行观察。结果 :异位子宫内膜标本中CD147表达增强 ,以膜分布为主 ;而无论有无子宫内膜异位症 ,在位子宫内膜中CD147表达无差异。结论 :CD147分子表达在异位子宫内膜和正常子宫内膜存在明显差异。CD147可能与子宫内膜异位症的发生密切相关。

凝血酶促进骨髓间充质干细胞增殖的作用与机制

本研究旨在探讨凝血酶促进人间充质干细胞(MSC)增殖及其机制。在无血清基础培养液中添加不同浓度凝血酶,用MTT实验检测人骨髓MSC增殖状态,PCR检测细胞蛋白酶活化受体(PAR)和c-MYC表达,Western blot分析信号通路的变化,并通过特异性抑制剂阻断凝血酶受体和信号通路,验证凝血酶作用的机制。结果显示,凝血酶可显著刺激MSC增殖,效应呈浓度依赖性;当凝血酶浓度为0.5 U/ml时,细胞增殖明显提高,浓度为8 U/ml时,刺激活性达峰值(P<0.01);PCR结果表明,MSC表达PAR-1和PAR2;当PAR1受体被阻断后凝血酶的促增殖效应被抑制,而PAR2受体被阻断后凝血酶对增殖结果影响不明显;凝血酶刺激MSC后,信号分子AKT发生磷酸化,c-MYC基因表达上调;当AKT信号通路被抑制后,c-MYC表达被抑制,凝血酶刺激细胞增殖效应被明显抑制。结论:凝血酶可通过PAR1受体介导的AKT信号通路的活化,上调MYC基因的表达,从而促进间充质干细胞的增殖。

SPK调节低氧诱导白血病细胞增殖及糖代谢的实验研究

目的:应用人红白血病TF-1细胞系模型,研究SPK信号通路在细胞增殖和糖代谢中的作用。方法:应用慢病毒介导的shRNA干涉策略,干涉TF-1细胞中SPK的表达。通过RT-q PCR和蛋白印迹技术检测SPK在TF-1细胞中干涉效率。应用CCK-8测定细胞增殖活力,通过流式细胞仪检测Annexin V染色确定细胞凋亡情况。结果:低氧能够诱导TF-1细胞中HIF-1α、HIF-2α和SPK的上调,证明SPK是低氧诱导表达的重要分子。SPK-shRNA转染能够明显抑制TF-1细胞的增殖并且诱导TF-1细胞的凋亡。SPK敲减明显减低细胞葡萄糖的利用和消耗。结论:SPK是参与调节低氧诱导细胞增殖和葡萄糖代谢的关键信号分子,在低氧诱导细胞反应中发挥重要作用。

过表达MEG3慢病毒载体构建及其对骨髓瘤细胞系XG-7凋亡的影响

目的：构建过表达母系表达印记基因MEG3（materally expressed gene 3,MEG3）全长的慢病毒载体,观察其对骨髓瘤细胞凋亡的影响。方法：以包含MEG3全长的包装质粒pcDNA3.0-MEG3为模板,设计针对MEG3全长的引物（寡核苷酸片段）,经PCR扩增后获得MEG3全长,并将其亚克隆入线性化的慢病毒表达载体pCDH-EF1-copGFP中,经双酶切、PCR及测序等方法鉴定。利用脂质体转染试剂将鉴定正确的pCDH-EF1-MEG3-copGFP重组质粒转染HEK-293T细胞,进一步通过荧光显微镜和流式细胞术检测GFP表达效率,real-time PCR检测MEG3mRNA表达水平。通过三质粒共转染及PEG纯化的方法获得慢病毒,以优化感染滴度感染骨髓瘤细胞系,通过流式细胞术检测过表达MEG3对细胞凋亡的影响。结果：经酶切、PCR及测序等方法证实成功构建pCDH-EF1-MEG3-copGFP过表达载体;通过流式细胞术测定制备的慢病毒滴度为1.86×10^8pfu/ml;流式细胞术检测和realtime PCR方法证实MEG3在293T细胞和骨髓瘤细胞中表达明显上调;流式细胞术检测证实过表达MEG3可诱导骨髓瘤细胞凋亡。结论：成功构建并制备过表达MEG3的慢病毒过表达载体pCDH-EF1-MEG3-copGFP,该载体能高效过表达MEG3并诱导骨髓瘤细胞凋亡,进一步证实了MEG3具有抑癌功能,为进一步研究MEG3调控骨髓瘤细胞生物学特性及机制奠定了基础。

Aurora激酶抑制剂VX-680对慢性髓系白血病细胞增殖及凋亡的影响

本研究探讨Aurora激酶抑制剂VX-680在体外对白血病细胞系K562、KCL22和慢性髓系白血病(CML)患者骨髓CD34+细胞的增殖和凋亡的影响。利用CCK-8法观察VX-680对K562和KCL22细胞的增殖作用,细胞计数方法测定VX-680对CML的CD34+细胞增殖影响,Annexin V-PI凋亡检测试剂盒、流式细胞术分析VX-680对K562、KCL22细胞凋亡效应,集落形成试验检测VX-680对CML及正常供者(donor)的骨髓CD34+细胞集落形成能力影响。结果表明,Aurora激酶抑制剂VX-680(20-100 nmol/L)在处理细胞第3天时能明显抑制K562和KCL22细胞增殖(P<0.01),并能抑制CML患者骨髓CD34+细胞增殖,而且随着剂量增加,抑制作用增强;VX-680(20nmol/L)作用K562和KCL22细胞3天时可诱导细胞凋亡(P<0.01);集落形成试验表明,CML患者骨髓CD34+细胞在VX-680的体外处理下集落形成能力较正常骨髓CD34+细胞明显下降(P<0.01)。结论:Aurora激酶抑制剂VX-680在体外对慢性髓系白血病细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用。

重组质粒pUDKH的质量分析

目的:分析研究pUDKH的质量。pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。方法:用光密度法分析pUDKH的浓度及纯度;用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋pUDKH比例及RNA;以地高辛标记的核酸探针固相斑点杂交法测定残留宿主DNA含量;用酶联免疫法测定残留宿主菌蛋白;以4组限制性内切酶分析一致性;PCR扩增目的基因片段;抑菌圈测定板测定残余抗生素;用鲎试剂检测细菌内毒素;对CHO细胞进行基因转染;ELISA检测上清HGF表达量;用Transwells法分析表达的上清液诱导ECV304细胞迁移数。结果:03批次pUDKH的浓度为1.97mg/mL,D260nm/D280nm值为1.84,超螺旋pUDKH比例为95.5%;电泳图谱中未见RNA;残留宿主DNA含量低于质粒DNA的0.2%;菌体蛋白质残留含量低于质粒DNA的0.1%;限制性酶切图谱与自行制备的对照品一致;PCR扩增到HGF基因片段,长约2.2kb;未见残余抗生素(卡那霉素)抑菌圈;细菌内毒素≤0.03125EU/mL;转染的CHO细胞上清HGF表达量为39.32ng/mL;表达的上清诱导ECV304细胞迁移数高于对照组2倍。结论:03批次pUDKH的质量符合药学规格。

重组腺病毒Ad5/F11p-GFP对不同肿瘤细胞系感染效率的比较研究

目的以Ad5-GFP及Ad5/F35-GFP为对照,评价Ad5/F11p-GFP对不同肿瘤细胞系的感染效率。方法制备并纯化Ad5-GFP、Ad5/F11p-GFP及Ad5/F35-GFP三种重组腺病毒,以不同的感染复数(MOI)感染乳腺癌细胞系SKBR-3、MCF-7及肾癌细胞系786O。48 h后,荧光显微镜观察GFP的表达,流式细胞仪检测感染效率及不同细胞表面柯萨奇腺病毒受体(CAR)、CD46和桥粒芯糖蛋白质2的表达。结果 Ad5/F35-GFP对SKBR-3、MCF-7及786O均具有很高的感染效率,且其在较低的MOI时就具有较高的感染效率;Ad5/F11p-GFP对CD46高表达的MCF-7及786O具有较高的感染效率,5 MOI感染即可达到60%以上的感染效率;而Ad5-GFP仅对CAR高表达的细胞系786O具有较高的感染效率,且感染效率随着MOI的增加而升高。Ad5/F11p-GFP和Ad5/F35-GFP对三种肿瘤细胞系的感染效率明显高于Ad5-GFP。结论对5型腺病毒进行纤维顶球的改造,可增强对肿瘤细胞的感染效率。

靶向型辅助腺病毒的构建及其功能研究

目的构建一种新型辅助腺病毒,并用于靶向型第三代腺病毒载体的制备,提高其对造血细胞的感染效率。方法采用重叠PCR的方法合成含有不完全包装信号序列A1-A4和loxP序列的DNA片段SynES,替换穿梭质粒pShuttle中原有的包装信号序列,得到穿梭质粒pShuttle-SynES;将所得穿梭质粒与骨架质粒Ad5/F11p在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得重组腺病毒质粒载体pAd5/F11p-HV,将其转染293细胞包装重组腺病毒Ad5/F11p-HV。参照第三代腺病毒包装策略,利用Ad5/F11p-HV包装获得携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的第三代腺病毒HD-Ad5/F11p-GFP;将其以不同的感染强度感染人白血病细胞系K562、U937、Jurkat和人脐带血CD34+细胞后,采用荧光显微镜和流式细胞术检测GFP的表达。结果采用DAN片段SynES替换穿梭质粒pShuttle上的包装信号,获得新的穿梭质粒pShuttle-SynES;进一步构建获得重组腺病毒质粒pAd5/F11p-HV,并制备了辅助腺病毒Ad5/F11p-HV。采用该辅助腺病毒包装pC4HSU-GFP,获得了第三代腺病毒HD-Ad5/F11p-GFP;CsCl密度梯度离心分离HD-Ad5/F11p-GFP和Ad5/F11p-HV,获得了高质量的HD-Ad5/F11p-GFP。与对照病毒HD-H14-GFP相比,HD-Ad5/F11p-GFP可明显提高对人白血病细胞U937、Jurkat和人脐带来源CD34+细胞的感染效率。结论设计并构建了一种靶向性辅助腺病毒,并以此为基础成功制备了对造血细胞高效感染的第三代重组腺病毒。

重组腺病毒Ad-GFP的纯化

目的:用色谱法纯化制备携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。方法:采用5L生物反应器悬浮培养HEK-293N3S细胞进行病毒的扩增,冻融法裂解细胞,通过超滤、Source15Q离子交换层析和Sepharose4Fast Flow凝胶过滤层析进行分离纯化,采用分光光度法和高效液相色谱法分析重组腺病毒产品的纯度,采用组织培养半数感染剂量方法测定病毒的感染滴度。结果:通过两步色谱层析得到产品,经分光光度法分析,其D260nm/D280nm比值为1.21,高效液相色谱法分析其纯度达96.5%,产品滴度为1.0×1011U/mL,病毒颗粒数为1.76×1012/mL,比活性为5.68%。结论:确定了稳定可行的重组腺病毒色谱分离工艺,得到的产品在纯度、滴度和比活性等方面均符合国家食品药品监督管理局的标准。

6 Gy γ射线照射对小鼠Th17细胞含量和血清IL-17A含量的影响

目的:观察6 Gyγ射线照射对Th17细胞含量及其细胞因子的影响,探讨辐射免疫损伤机制。方法:60只C57BL/6雄性小鼠随机分为照射组和对照组,每组30只。照射组小鼠接受6 Gyγ射线一次性全身照射,对照组未进行照射。于照射后1、3、7、14和28 d取小鼠脾脏制备细胞匀浆,采用流式细胞术检测脾脏Th17细胞比例的改变;应用ELISA方法检测照射后6 h及1、3、7、14、28 d血清IL-17a含量变化。结果:6 Gyγ射线照射后1 d,小鼠脾脏Th17细胞比例即出现显著增加,至照后28 d仍显著高于对照组(P<0.05或P<0.01),但照射后各时间点血清中IL-17a水平与对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。结论:6 Gyγ射线全身照射引起小鼠Th17细胞比例明显升高,表明Th17细胞在辐射所致免疫功能损伤和炎症反应中具有重要作用。

小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1对脐静脉内皮细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的探讨小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1(SENP1)对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移及凋亡的影响。方法用20个感染复数的p LKO.1-SENP1-小发夹RNA(shRNA)-绿色荧光蛋白(GFP)干涉慢病毒(SENP1干涉组)和p PIG-U6-随机序列(scramble)-GFP对照慢病毒(GFP-SC对照组)感染HUVEC。病毒感染HUVEC 48 h后,用流式细胞仪检测慢病毒的感染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western蛋白质印迹法检测HUVEC内SENP1基因和蛋白表达水平。用CCK8试剂盒检测细胞增殖能力,Transwell小室法检测细胞的迁移能力,流式细胞仪分析细胞凋亡率。结果 GFP-SC对照组和SENP1干涉组感染效率均>97%。与GFP-SC对照组比较,SENP1干涉组HUVEC SENP1基因和蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。CCK8法测定结果表明,SENP1干涉组HUVEC增殖能力较GFP-SC对照组明显降低(P<0.01)。SENP1干涉组细胞迁移过Transwell小室的细胞数量明显低于GFP-SC对照组(P<0.01)。用低浓度血清(含2%胎牛血清)培养基诱导细胞凋亡24 h,SENP1干涉组细胞凋亡率即已升高到GFP-SC对照组的2倍左右(P<0.05);诱导凋亡至48 h,SENP1干涉组细胞凋亡率升高到对照组的3.2倍左右(P<0.05)。结论 HUVEC内SENP1表达水平的降低不仅可以显著抑制细胞增殖和迁移能力,亦可促进细胞凋亡。

免疫组化法检测NSCLC骨髓微转移的临床研究

目的 探讨免疫组化检测非小细胞肺癌 (NSCLC)患者骨髓微转移 (BMM )的灵敏度、特异性及临床应用价值。方法 应用免疫组化法检测 6 8例经病理检查证实的NSCLC患者骨髓 (临床分期Ⅰ～Ⅲ期5 3例 ,Ⅳ期 15例 )细胞角蛋白表达 ,诊断肺癌BMM。结果 免疫组化检测BMM的敏感度可达 10 -5水平 ;Ⅰ～Ⅲ期患者BMM阳性率为 2 2 .6 % ( 12 /5 3) ;性别、年龄、卡氏评分、病理类型等因素对BMM阳性率无显著性影响 ;Ⅳ期患者BMM阳性检出率为 5 3.3% ( 8/15 ) ,显著高于Ⅰ～Ⅲ期患者。结论 免疫组化方法检测NSCLC患者的BMM具有较好的敏感性和特异性 。

重组质粒pUDK-PmL-IR-GM的体内免疫激活作用

目的构建携带融合蛋白基因PSA-IZ-mCD40L(PmL)和GM-CSF基因的重组质粒载体pUDK-PmL-IR-GM,并评价其小鼠体内免疫激活作用。方法采用类似基因合成的方法将前列腺特异性抗原基因、异亮氨酸拉链基因和鼠源性CD40配体基因连接并扩增获得融合蛋白基因PmL。将GM-CSF、PmL和核糖体内部进入位点基因依次克隆到pUDK载体,获得重组质粒pUDK-PmL-IR-GM。分别于第1、11、21和35天免疫小鼠,末次免疫后10d分离小鼠脾脏T淋巴细胞。采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群;MTT法检测前列腺特异性抗原刺激下的T淋巴细胞增殖效应;非放射性细胞杀伤检测试剂盒检测对LNCaP细胞的特异性杀伤作用。结果 PCR成功扩增GM-CSF基因和融合蛋白基因PmL,并将其克隆至pUDK载体上,以核糖体内部进入位点连接,得到重组质粒pUDK-PmL-IR-GM。pUDK-PmL-IR-GM免疫小鼠后,T淋巴细胞性能检测显示:CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞的比值较对照组明显升高(P<0.05);前列腺特异性抗原刺激后,其增殖能力明显增强(与阴性对照相比,P<0.01),且明显高于其他免疫组(P<0.01);其对LNCaP细胞杀伤效率大于25%,且明显强于pUDK免疫组(P<0.05)。结论成功构建重组质粒载体pUDK-PmL-IR-GM,并证实其能在一定程度激活小鼠T淋巴细胞的特异性免疫反应。

TGF-β3在小鼠放射性肺纤维化中的作用研究

目的观察经60Coγ射线全胸照射后小鼠肺脏的改变,探究转化生长因子-β3(TGF-β3)在小鼠放射性肺纤维化中的作用。方法 180只C57BL/6雌性小鼠随机分为对照组、照射组和TGF-β3组。照射组和TGF-β3组经60Coγ射线单次全胸照射,照射后每周分别腹腔注射0.5 ml 0.9%生理盐水和TGF-β3(1μg/kg)一次。于照射后3、7、14 d和1、3、6个月活杀,肺脏经HE和天狼星红染色观察病理,检测小鼠肺内循环纤维细胞(CF)的数量。结果建立小鼠放射性肺纤维化模型。照射后6个月时,TGF-β3组肺脏见点状实变,部分成纤维细胞增生,少量胶原纤维沉积。照射后14 d到6个月,照射组肺脏CF数量比对照组明显增加(P<0.05)。照射后1个月时,TGF-β3组肺脏CF数量比照射组明显减少(P<0.05)。结论 TGF-β3使CF在肺内的聚集明显减少,其可能在延缓肺纤维化发生过程中发挥重要作用。