不同原理的PCR方法用于地中海贫血产前诊断的验证应用

目的:评估两种不同技术原理的PCR方法用于地中海贫血(下称"地贫")产前诊断的必要性和可行性。方法 :采用双盲法,对509份产前诊断标本分别采用单管多重PCR法(single-tube multiplex PCR,STMP)+反向点杂交法(reverse dot blot,RDB)、探针熔解曲线法(probe melting curve assay,PMCA)检测常见α-地贫和β-地贫基因突变。两种方法所得结果不一致或少见类型地贫突变时,采用DNA测序分析法确诊。所有产前诊断结果均进行验证或随访。结果 :经STMP+RDB、PMCA检测突变谱不同,α-地贫和β-地贫各有1例结果不同。另STMP+RDB检测灵敏度高于PMCA,其差异性在标本受母血污染时有提示作用。结论:两种不同技术原理的PCR方法进行地贫产前诊断,是必要和可行的,两者具有互补性,可确保结果的可靠性和减少单一技术的缺陷。

单管多重PCR结合RDB技术在α-地贫产前诊断中的应用

目的基因诊断结果在α-地贫的产前诊断中具有决定意义。采取两种不同技术原理的方法验证产前诊断结果,是保证产前诊断结果可靠性的基本要求。本文探讨检测常见非缺失型α-地贫的RDB技术作为单管多重PCR技术产前诊断α-地贫验证方法的可行性。方法采用双盲法,对73例α-地贫产前诊断的标本分别采用针对中国人3种常见缺失型α-地贫突变的单管多重gap-PCR技术和针对常见3种非缺失α-地贫点突变的RDB法进行分析,根据单管多重PCR技术扩增产物电泳图谱和RDB膜条上显色的斑点分别判断某一个标本缺失型和非缺失α-地贫的突变类型,且与引产或出生后胎儿脐带血中HbBart′s定量结果进行比对。结果单管多重PCR和RDB技术均能分别准确检出常见缺失型和非缺失型α-地贫各种突变类型。如将两者结合分析,还能提供相互佐证的重要信息:对于--SEA、-α3.7和-α4.2自身或相互组合的各种基因型标本,其RDB膜条的杂交斑点均不显色;而--SEA与αCSα、αQSα和αWSα组合的基因型标本该突变的正常对照点不显色。α-地贫产前诊断结果与胎儿脐带血电泳结果完全吻合。结论单管多重PCR结合RDB技术同时应用于α-地贫的基因诊断,可保证产前诊断的可靠性,值得在临床遗传诊断实验室中推广应用。

珠海户籍人群小细胞低色素性贫血个体中地中海贫血发生率

目的:调查珠海市户籍人群小细胞低色素性贫血个体中地中海贫血(简称地贫)的发生率、基因突变类型及其分布特征。方法:采用已建立的技术和方法分析珠海市户籍人群小细胞低色素性贫血门诊患者的珠蛋白基因型和其他血液学指标。结果:在所研究的372例病例中(其中儿童和孕妇各为89和61例),检出α-、β-地贫表型阳性和缺铁(ID)病例各154、146和72例(其中儿童和孕妇病例各为40例和26例)。经基因分析,有191和144例分别被确定了α-和β-地贫基因型(各含201和147个突变等位基因,其中有5例β合并α-地贫)。另外尚有5个和2个分别为α-和β-地贫表型阳性的病例未能确定其基因型。据此得出珠海市户籍人群小细胞低色素性贫血病例地贫基因检出率和携带率分别为91.94%和95.43%(未知基因型以杂合子计),α-合并β-地贫的机率为1.34%;ID的发生率为23.92%,儿童和孕妇ID的发生率各为44.94%和42.62%。ID病例地贫基因检出率高达60.67%。地贫合并ID个体占16.02%。此外,还发现单纯性小细胞低色素症(平均红细胞容积和平均红细胞血红蛋白量均降低,但不贫血)的个体有更高的地贫基因检出率(96.89%)和携带率(97.78%)。结论:珠海市户籍人群小细胞低色素性贫血特别是单纯性小细胞低色素症病例有很高的地贫基因携带率。虽然ID在该市儿童和孕妇个体中很常见,但此类个体也有不低的地贫基因检出率。由于小细胞低色素性贫血通常被认为是ID的指征,故该研究所得出的结论具有很强的临床针对性和重要的优生优育学意义。

G6PD活性、UGT1A1、SLCO1B1、ABCC2基因多态性和新生儿高胆红素血症的关系研究

目的探讨体内胆红素转运与排泄相关基因(UGT1A1,SLCO1B1和ABCC2)的功能性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNPs)位点,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)活性与新生儿血清胆红素峰值浓度的关系。方法 457例新生儿同时采用经皮测和血清胆红素测定,采用G6PD/6PGD比值法和荧光斑点法测定G6PD活性,采用测序法分析所有标本的8个SNPs位点的基因型,统计学分析G6PD活性、各个SNPs位点与总胆红素峰值的关系。结果G6PD缺乏组血清总胆红素浓度峰值为(276.55±94.92)μmol/L,G6PD正常组血清总胆红素浓度峰值为(220.12±89.39)μmol/L,两者之间差异有统计学意义(P<0.001);8个SNPs位点与血清总胆红素浓度相关性分析中,UGT1A1 211 G>A在显性遗传模型、隐性遗传模型和加性遗传模型下均显著影响新生儿外周血胆红素浓度(P<0.01),SLCO1B1-11187G>A在显性遗传模型下显著影响新生儿外周血胆红素浓度(P=0.039)。携带G6PD活性缺乏、UGT1A1 211 G>A和SLCO1B1-11187G>A这3个风险因素组发生新生儿高胆红素血症的风险是不携带上述3个风险因素组的8.78倍(95%置信区间:2.72~28.39)。结论 G6PD活性缺乏、UGT1A1 211 G>A和SLCO1B1-11187G>A为新生儿高胆红素血症发生的3个重要风险因素,三者之间具有积累效应,携带风险因素的数量越多,新生儿外周血胆红素峰值浓度就越高,发生新生儿高胆红素血症并发症的风险就越大。

地中海贫血产前遗传筛查流程简化的风险评估

目的评估全血细胞分析(full blood count,FBC)结合常见地中海贫血(简称地贫)基因检测(简称两步法)取代传统的FBC结合血红蛋白(hemoglobin,Hb)分析和地贫基因检测(简称三步法)用于地贫产前遗传筛查的可行性。方法采用回顾性分析的方法,对近2年(2014年1月1日至2015年12月31日)珠海市产前门诊6 291名孕妇及其配偶FBC、Hb分析和地贫基因检测的结果采用x2检验进行统计学分析,比较两步法和三步法在产前地贫遗传筛查中的可靠性及经济性。结果以经典的三步法作为标准,两步法对孕妇及其配偶地贫检测的灵敏度、特异性、阴性预测值和阳性预测值以及总的诊断效率分别为98.25%、99.52%、85.98%、88.12%、91.23%,两步法对血红蛋白H(hemoglobin H,Hb H)病、轻型β-地贫、异常Hb和δβ-地贫/遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(hereditary persistence of fetal hemoglobin,HPFH)的漏检率分别为2.59%(2/77)、0.01%(2/1 695)、8.78%(13/148)和48.30%(43/89)。结论产前地贫遗传筛查流程中采用三步法有其科学性,既可避免Hb H、异常Hb以及δβ-地贫/HPFH等个体的漏检,还可为地贫DNA诊断指明方向。在未建立覆盖中国人异常Hb病基因谱的分子筛查技术之前,两步法暂不能取而代之。

中国人常见G6PD基因突变的快速检测

目的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺乏症是世界上最常见的遗传性红细胞酶缺陷病。本文探讨建立一种简便快速、准确可靠、经济实用的G6PD缺乏症分子诊断技术。方法采用DNA测序技术通过双盲法对所建立的单管多重PCR结合分子杂交技术进行方法学评价。结果所建立的新技术可成功地检出上述中国人常见的G6PD基因突变并能清楚区分男性杂合子、女性杂合子或纯合子或双重杂合子。盲法分析结果显示,该技术对经DNA直接测序确诊的G6PD标本的诊断准确度和重复性均达到100%。结论单管多重PCR结合分子杂交技术可准确、快速地检测中国人常见的G6PD基因突变且具有经济和实用的优点,非常适合于G6PD缺乏症的大人群分子筛查和临床样品的基因诊断。

带锁髓内钉治疗股骨干骨折的临床分析

目的探讨带锁髓内钉治疗股骨干骨折失败的原因及其预防措施。方法回顾性分析本院2000年1月～2007年8月76例采用带锁髓内钉治疗股骨干骨折患者的临床资料,发生并发症12例,内固定失败6例。结果并发症有术中股骨颈骨折2例,肺栓塞1例,术后感染1例,大粗隆部疼痛2例,膝外翻2例,膝关节活动障碍2例,骨折端再骨折1例,骨不连1例;内固定失败按失败原因可分为主钉断裂2例,远端锁钉退出1例,膝关节纤维性强直2例;迟发感染1例。手术技术、手术适应证选择、康复锻炼的规范性、髓内钉的强度及合适与否是导致失败的相关原因。结论应用带锁髓内钉治疗股骨干骨折应掌握好适应证,强调术前准备充分,术中操作规范,术后锻炼应循序渐进,避免过早负重,是减少或防止内固定失效及并发症的重要措施。

珠芽蓼黄酮类化合物清除DPPH·的作用

以六盘水市本地野生的珠芽蓼为原料,利用70%乙醇作为提取介质提取黄酮类化合物,并以抗坏血酸(VC)和维生素E(VE)为对照物,采用DPPH法研究珠芽蓼黄酮提取物对二苯代苦味肼基自由基(DPPH.)的清除作用。结果表明:珠芽蓼黄酮对DPPH.有较强的清除作用,在其质量浓度为368.94μg/mL时,其清除效果最好,清除率达88.96%,显著高于相同浓度下的VC和VE的清除率。珠芽蓼黄酮提取物是一种有前途的抗氧化剂。

超临界CO_2萃取桑叶总黄酮工艺的研究

采用超临界CO2萃取桑叶总黄酮,以得率为指标,对萃取压力、萃取温度、夹带剂乙醇的浓度和流量等影响因素进行正交试验。结果表明最佳工艺条件为:萃取压力35 MPa,温度55℃,乙醇质量分数90%,乙醇流量0.01 mL/min。此条件下桑叶总黄酮得率2.28%。该方法简便、可靠、选择性高,适于工业化生产。

HPLC测定蒲公英中槲皮素含量的研究

[目的]建立蒲公英中槲皮素含量的测定方法。[方法]采用高效液相色谱法,AgilentC18柱(150.0mm×4.6mm,5.0μm),流动相为甲醇-乙腈(63∶26),紫外检测波长为370nm。[结果]槲皮素在0.1～1.0mg/ml范围内线性关系良好,平均回收率为98.37%。[结论]该方法分离好、快速、重复性好,可作为蒲公英的质量控制方法。

贵阳市红枫湖底栖生物体中多溴联苯醚的初步研究

为了研究贵阳市红枫湖底栖生物体中多溴联苯醚(polybrominateddiphenyl ethers,PBDEs)的污染情况,通过索氏抽提、凝胶色谱柱和多层硅胶/氧化铝层析柱净化,对红枫湖底栖生物体中PBDEs的含量、分布模式、来源进行分析。结果表明,红枫湖样品中Σ18PBDEs为105.71～43902.73 pg/g(干重),各单体含量为1.05～20045.38 pg/g。红枫湖底栖生物体中PBDEs的污染尚处于较低水平。

均匀设计法优选蒲公英总黄酮的研究

目的探讨超声辅助提取蒲公英总黄酮的最佳工艺。方法采用均匀设计优化提取工艺。结果最优工艺参数为:超声波强度2000W,温度75℃,乙醇浓度75%,黄酮提取率为2.59%。结论均匀设计法优选蒲公英总黄酮,简洁快速,可以用于优选蒲公英总黄酮。

小切口微创手术治疗老年股骨颈骨折早期疗效分析

目的分析微创后外侧小切口手术治疗老年股骨颈骨折(GardenⅢⅣ型)的早期疗效。方法回顾性分析我院2005年10月至2009年10月进行人工全髋关节置换术的45例资料,平均年龄73.5岁。微创小切口组23例与标准切口组22例进行比较。结果 2组资料患者年龄、术前诊断及髋关节Harris评分均无显著差异。平均体重指数微创小切口组小于标准切口组。其余各项指标小切口组均优于标准切口组,并且具有显著性差异。结论微创后外侧小切口技术具有创伤小、出血少、恢复快的特点,适合治疗老年股骨颈骨折患者,在临床中可推广应用。

异常血红蛋白的筛查及其分子诊断

目的应用高效液相色谱法(HPLC)检测异常血红蛋白(Hb)并对各异常Hb进行分子诊断。方法收集6 297例血样,采用HPLC检测各种异常Hb,应用Sanger测序法对各异常Hb进行DNA测序。结果共发现7种异常Hb,分别为Hb E(37例)、Hb Q(18例,其中3例为Hb Q-Hb H)、Hb S(2例)、Hb C(2例)、Hb D-Iran(3例)、Hb J-Bangkok(8例)、Hb J-Mexico(2例)。经DNA测序,Hb E、Hb Q、Hb C及Hb J-Bangkok得到确诊;2例Hb S中1例为Hb S纯合子,另1例为Hb G-Makassar;3例Hb D-Iran中2例为Hb G-Taipei,1例为Hb G-Coushatta;2例Hb J-Mexico被证实为Hb Ube-2。结论虽然HPLC能快速检测异常Hb,但只能进行"假设性诊断",确诊还需通过分子生物学方法。

逐步回归分析快速鉴别诊断地中海贫血与缺铁性贫血

目的快速鉴别诊断地中海贫血与缺铁性贫血。方法利用红细胞指数建立鉴别诊断地中海贫血与缺铁性贫血的逐步回归方程,并用盲法分析评价其准确鉴别性。结果该方程鉴别诊断地中海贫血与缺铁性贫血的准确度为86.82%,对地中海贫血和缺铁性贫血预测的灵敏度、特异度、约登指数分别为94.29%、79.66%、73.9和76.92%、90.52%、67.4。结论红细胞指数逐步回归方程鉴别诊断地中海贫血与缺铁性贫血简便、快速、敏感,适合基层单位开展。

应用高效液相色谱法检测β-地中海贫血及异常血红蛋白

目的应用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)准确、快速检测β-地中海贫血及各种异常血红蛋白,分析β-地中海贫血及异常血红蛋白病在人群中的发生情况。方法全自动血细胞分析仪检测红细胞指数;HPLC测定Hb A2和Hb F;采用碱性琼脂糖凝胶电泳进行血红蛋白电泳对各异常血红蛋白进行鉴定;RDB法分析β-地贫基因型。结果应用HPLC分析了2 841份标本,其中β-地中海贫血轻型578例(20.34%),β-地贫重型和中间型各4例。同时发现7种异常血红蛋白,分别为Hb E(17例,其中1例为Hb E合并β-地中海贫血)、Hb Q(7例,其中1例为Hb Q/Hb H)、Hb S(1例Hb S纯合子和1例Hb S杂合子)、Hb D-Iran(2例)、Hb Manitoba(1例)、Hb J-Bangkok(2例)和Hb C(1例)。结论 HPLC是一种用于检测β-地中海贫血及异常血红蛋白的理想实验工具,能为各种血红蛋白病提供快速而又准确的诊断依据。

静止型α-地中海贫血红细胞指标临界值的确定及其应用

目的探讨并评估红细胞相关指标及其临界值用于筛查静止型α-地中海贫血(α-地贫)的临床价值。方法以77例单纯性静止型α-地贫患者和151例健康成人为研究对象,采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)确定静止型α-地贫筛查指标及其临界值。结果 MCV、MCH、MCHC的ROC曲线下面积分别为0.857,0.858,0.740,均有筛查价值,其最佳临界值分别为82.0fl、28.0 pg和341.5 g/L;MCV≤82.0 fl或MCH≤28.0 pg平行模式筛查静止型α-地贫的灵敏度、特异度和漏诊率分别为93.5%、72.8%和6.49%。结论采用MCV≤82.0 fl或MCH≤28.0 pg平行模式可有效检出静止型α-地贫,为地贫高发区进行遗传咨询提供了一定的科学依据。

三种红细胞渗透脆性试验用于地中海贫血筛查的临床应用评价

目的 评价临床上常用的 3种红细胞渗透脆性试验作为临床地中海贫血 (地贫 )筛查技术的准确性及其应用价值。方法 以双盲试验对临床送检的 45 3份血样分别采用 3种红细胞渗透脆性试验、分子筛查手段和铁代谢状态分析检测红细胞溶血率、珠蛋白基因型和缺铁性贫血。结果 以分子筛查方法结合铁代谢状态作为诊断地贫和缺铁性贫血的金标准 ,双管、改良的单管和两管红细胞渗透脆性试验筛查地贫的有效率分别为 90 .3 %、86.8%和 85 .4% ;特异性分别为 99.4%、99.4%和 10 0 % ;敏感度分别为 88.6%、84.3 %和 77.7% ;总的误诊率分别为 9.7%、13 .2 %和 14 .6% ;对孕妇血样漏检率分别高达 2 7.7%、3 4.4%和 3 7.7%。结论 三种红细胞脆性试验均能较好地筛出地贫 ,其中以双管法最佳、单管法次之 ,两管法居末 ,但这些方法均不宜作为妊娠期筛查地贫的技术手段。

微量血25(OH)D_3测定对佝偻病的诊断价值初探

【目的】 探讨末梢血血清 2 5羟维生素D3 [2 5 hydroxyvitaminD3 ,2 5 (OH )D3 ]对诊断婴幼儿佝偻病的价值 ,初步制定正常参考值范围。 【方法】 采用分层随机抽样法抽取珠海市 0～ 2岁婴幼儿 40 5人 ,以竞争蛋白结合放射免疫法测定末梢血和部分静脉血血清 2 5 (OH)D3 水平。 【结果】 静脉血和末梢血 2 5 (OH )D3 水平高度相关 ;佝偻病患儿和正常婴幼儿末梢及静脉血中 2 5 (OH )D3 水平差异有非常显著性。 【结论】 静脉血和末梢血 2 5(OH)D3 均能早期诊断佝偻病 ,可检测末梢血中 2 5 (OH)D3 以替代静脉血 2 5 (OH )D3 。

小细胞低色素性贫血儿童和孕妇的病因分析

目的:调查珠海市户籍儿童和孕妇发生小细胞低色素性贫血的原因。方法:采用已建立的技术和方法分析珠海市妇幼保健院门诊小细胞低色素性贫血儿童和孕妇病例的珠蛋白基因型和铁代谢状态及其他血液学指标。结果:271例小细胞低色素性贫血儿童和孕妇病例中,检出α-、β-地中海贫血(地贫)表型阳性和缺铁(ID)病例分别为80例、93例(其中17例合并ID)和98例。经基因分析,115例和93例分别被确定为α-地贫和β-地贫基因型(各含124和96个突变等位基因,其中包括3例β-合并α-地贫)。另外尚有3个α-地贫和2个β-地贫表型阳性的病例未能确定其基因型。据此得出珠海市户籍小细胞低色素性贫血儿童和孕妇的地贫基因检出率和携带率分别为76.75%和81.18%(未知基因型以杂合子计),α-地贫合并β-地贫的机率为1.11%;ID的发生率为42.44%,ID病例地贫基因检出率高达45.22%,地贫合并ID个体占25.00%。此外,还发现单纯性小细胞低色素症个体有更高的地贫基因检出率(85.31%)和携带率(86.01%)。结论:该研究阐明了地贫是引起珠海市户籍儿童和孕妇发生小细胞低色素性贫血特别是单纯性小细胞低色素症最主要的原因,其次为ID,地贫合并ID位居第3。同时还发现ID个体有不容忽视的地贫基因检出率。由于小细胞低色素性贫血通常被认为是ID的指征,故该研究所得出的结论具有很强的临床针对性和重要的优生优育学意义。