半楼贝蔹及配伍乌头对大鼠肝细胞色素P^(450)酶含量的影响

[目的]研究中药十八反中半夏、贝母、栝楼、白蔹、白及配伍乌头对大鼠肝细胞色素P450 酶含量的影响。[方法]采用紫外分光光度测定大鼠肝微粒体细胞色素P450与细胞色素b5含量。[结果]配伍组与其相应单药组比较可显著降低P450酶及b5含量(P<0.001或P<0.05)。[结论]药物配伍后导致P450酶变化 ,对药物的代谢产生影响。

甘草、芫花合用对大鼠肝脏细胞色素P450酶的影响

目的:为了阐明基于药物代谢酶的中药十八反产生相反作用的机制,选择相反药对甘草、芫花作为研究对象,研究二者合用对主要药物代谢酶CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1/2酶活性的影响.方法:采用高效液相色谱法测定CYP1A2、CYP2E1活性;采用紫外-可见分光光度法测定CYP3A1/2活性.结果:甘草、芫花合用后CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1/2的酶活性增加,与对照组比较有显著差异(P＜0.05～0.001).结论:两药合用对药物代谢酶的影响可能会使某些药物毒性成分在体内代谢特征发生改变,对药物的疗效或毒性产生影响,从而产生基于药物代谢酶的中药间相互作用.

四物汤不同部位对辐射小鼠外周血象的影响

目的观察四物汤不同分离部位对3.5 Gy照射小鼠外周血象的影响,发现四物汤补血作用的活性部位。方法60只小鼠常规饲养适应环境后,采用60Co-γ射线3.5 Gy全身一次照射,照射后立即给予四物汤不同分离部位,连续给药7 d,在照射后1、3、5、7、9、11、13、15、17、19 d检测其对外周血象的影响。结果与模型对照组相比,四物汤不同洗脱分离部位在不同时间点可以升高辐射致血虚证小鼠外周血白细胞、红细胞和血小板,其中水洗脱部分对辐射致血虚证小鼠补血效果较佳。结论四物汤补血作用的主要物质为多糖、单糖等大极性成分。

Wistar大鼠二年喂养对其生存、体质量、进食量及自发性肿瘤发生率的观察与分析

目的 Wistar大鼠二年喂养对其生存、体质量及进食量进行观察与分析。方法对Wistar大鼠连续2年观察其肿瘤发生及生存情况。每周测定大鼠的体质量和进食量。结果雄性大鼠死亡率、死亡动物平均活存时间具有高于雌性大鼠的趋势,雌性大鼠的自发性肿瘤发生率较雄性大鼠略高,并且存在同一只大鼠多器官发生肿瘤的现象。实验期间雌雄大鼠进食量与进水量无明显变化,体质量在实验早期持续增长,在实验中晚期达到峰值,此后略有下降。日摄食量与体质量百分比在实验早期呈下降趋势,在实验中晚期达到极小值后略有回升。结论建立了Wistar大鼠实验室相关的正常值参考范围,为建立和开展新药对啮齿类动物致癌性试验的评价提供依据。

长期饲养的Wistar大鼠自发性肿瘤、脏器变化与死亡原因分析

目的喂养Wistar大鼠二年,观察试验期内存活与死亡大鼠的脏器质量、脏器系数及自发性肿瘤发生情况,并分析试验期内死亡动物的死亡原因。方法对试验期结束尚存活的动物、试验中濒死或死亡的动物,及时进行大体解剖及组织病理学检查,称其脑、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、胸腺、卵巢、子宫、睾丸及附睾脏器质量并计算脏器系数,观察是否有自发性肿瘤发生。结果试验观察104周存活大鼠雌性与雄性间比较,体质量、脑、心脏、肺脏、肝脏、脾、肾脏、肾上腺脏器质量及脑、肾上腺脏器系数差异显著。通过对试验期内死亡或濒死的动物大体解剖及组织病理学检查,80.5%大鼠因肿瘤性病变导致恶液质、多脏器衰竭死亡,17.1%大鼠因非瘤性病变致多脏器衰竭死亡,2.4%大鼠因其他病变致脏器衰竭死亡,雌雄动物间死亡原因未见统计差异。结论本实验为Wistar品系大鼠致癌性试验提供了相关的背景资料,肿瘤性病变是Wistar品系大鼠致死的主要原因。

老年Wistar大鼠自发性肿瘤及血液生化检测

目的 观察老年Wistar大鼠自发性肿瘤发生情况、检测血液学及血清生化指标变化.方法 SPF级Wistar大鼠饲养2年后处死,测定动物外周血及血清生化指标,在试验过程中观察动物的一般状态,记录自发性肿瘤发生情况.结果 Wistar大鼠饲养于SPF设施,共观察104周,皮肤和皮下组织、脂肪组织系统肿瘤最为多见,其次为神经系统、生殖系统.消化系统肿瘤仅发生于雄性大鼠.白细胞、红细胞平均体积、碱性磷酸酶、白蛋白、葡萄糖、总胆固醇和肌酸激酶性别间差别显著.结论 建立老年Wistar大鼠的相关正常值参考范围,为建立和开展新药的啮齿类动物致癌性试验评价提供基础数据.

人参、藜芦合用对大鼠肝P450酶活性及mRNA表达的调控作用

目的 :研究中药十八反中人参与藜芦合用对P4 5 0同工酶在酶活性及mRNA水平的调控作用。方法 :采用紫外分光光度法测定大鼠肝微粒体细胞色素P4 5 0与细胞色素b5含量及氨基比林N 脱甲基酶 (APND)、对硝基苯酚羟化酶 (pNPH)活性。采用RT PCR技术检测大鼠肝中 5种P4 5 0同工酶CYP1A1,CYP2B1/ 2 ,CYP2C11,CYP2E1及CYP3A1mRNA的表达。结果 :人参与藜芦合用可明显降低P4 5 0蛋白含量 ,可降低细胞色素b5的含量 ,单药及其与藜芦配伍都能使APND活性下降。在mRNA水平上 ,藜芦可诱导CYP2C11的基因表达 ,与人参合用后却使得CYP2C11的表达下降。藜芦与人参配伍诱导了CYP1A1的表达。人参可抑制CYP2B1/ 2的基因表达 ,与藜芦合用后却明显诱导了CYP2B1/ 2的表达 ,人参与藜芦合用后也明显诱导了CYP3A1的表达。结论 :人参与藜芦配伍前后对一些CYP亚型调控作用发生明显变化 ,可能存在基于药物代谢酶机理的相反作用 ,需进一步结合代谢研究加以综合分析 。

甘遂配伍甘草对大鼠肝脏CYP2E1表达及活性的影响

目的 通过检测细胞色素氧化酶CYP2E1的表达和活性变化,从分子水平探讨中药配伍禁忌“十八反”理论中甘遂配伍甘草的药理机制。方法 利用RT PCR检测大鼠肝脏CYP2E1mRNA水平;通过Westernblot检测大鼠肝脏CYP2E1蛋白表达;采用高效液相色谱(HPLC)法测定CYP2E1酶活性。结果 甘遂组、甘草组和甘遂甘草配伍组均明显诱导大鼠肝脏CYP2E1的表达与活性上升,并发现甘草组和甘遂甘草配伍组对CYP2E1活性的诱导作用显著高于甘遂组。结论 甘遂可能通过诱导肝脏CYP2E1的表达与活性上升,促使其所含的前致癌物质和前毒物转化成为致癌物和毒物,导致对机体的毒性作用;甘遂甘草配伍使用时,甘草对CYP2E1活性的诱导能力更强,故而甘草可促进甘遂所含前致癌物质和前毒物转化成为致癌物和毒物的过程,并导致对机体毒性作用的增强,从而表现出“十八反”中药物配伍禁忌的特征。

四物汤及其提取物对辐射致血虚证小鼠造血作用的研究

[目的]探讨四物汤及其提取物治疗辐射致血虚证小鼠的作用机制和有效物质基础。[方法]γ射线全身照射小鼠制成血虚证模型,观察四物汤对其外周血和造血祖细胞集落的影响 ,基因芯片检测有效单体芍药苷的分子作用机制。[结果]四物汤、正丁醇提取物、水溶提取物对血虚证小鼠外周的白细胞的恢复有明显促进作用 ;四物汤和芍药苷增强血虚证小鼠骨髓造血干祖细胞的集落形成能力 ;芍药苷可促进骨髓基质细胞分泌造血因子 (G -CSF ,GM -CSF ,PDGF -α)等 ,抑制造血抑制因子(M -CIP)的分泌。[结论]四物汤补血的物质基础可能是芍药苷 ,促进骨髓基质细胞分泌G -CSF ,GM -CSF ,PDGF -α等造血因子可能是四物汤补血的作用机制之一。

银杏内酯B通过激活孕烷X受体诱导CYP3A4的表达

目的研究银杏内酯B(ginkgolide B)对CYP3A4的诱导作用,进一步验证是否通过激活孕烷X受体实现对CYP3A4 mRNA和蛋白水平的诱导表达。方法用不同浓度银杏内酯B处理LS174T细胞,通过Q-PCR法检测CYP3A4 mRNA表达变化,进一步利用本实验室构建的PXRCYP3A4稳定转染HepG2工程细胞株,结合荧光素酶报告基因技术,显示检测银杏内酯B对PXR的转录激活活性的影响。蛋白质免疫印迹法检测CYP3A4蛋白水平表达的变化;利用siRNA技术敲低PXR的mRNA表达,检测在PXR低表达的条件下银杏内酯B对CYP3A4 mRNA和蛋白水平表达影响。结果银杏内酯B可以浓度依赖性的使CYP3A4基因及蛋白表达水平上调,报告基因结果显示,银杏内酯B能够浓度依赖性的增强PXR的转录激活活性,在PXR低表达的条件下,银杏内酯B对CYP3A4诱导作用明显低于正常表达组PXR。结论以上表明银杏内酯B通过激活PXR受体,促进其转录激活活性进而诱导CYP3A4表达上调,同时对PXR自身的表达无明显影响。

麦冬皂苷D通过降低自噬抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大

目的麦冬皂苷D是否抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)所引起的心肌肥大及其可能机制。方法体外培养大鼠心肌细胞系H9c2,MTS法检测麦冬皂苷D的细胞毒性;其次将1μmol·L^(-1)的AngⅡ作用于H9c2细胞24h后引起心肌肥大,用不同浓度的麦冬皂苷D(ophiopogonin D,OPD)共处理,BCA法检测总蛋白含量;实时荧光定量PCR技术检测标志性肥大基因BNP和β-MHC的mRNA表达;Western blot法检测自噬蛋白LC3B的表达,同时运用高内涵筛选技术检测心肌细胞自噬蛋白LC3B的表达以及线粒体膜电位的改变。结果细胞活力的检测结果显示,与对照组相比,AngⅡ不同浓度作用24 h后,对细胞活力无明显影响,而麦冬皂苷D的高浓度(50~100μmol·L^(-1))可明显抑制细胞的活性;AngⅡ作用于心肌细胞24h后,可引起心肌肥大,导致特异性肥大基因mRNA表达上调,并且明显增加细胞总蛋白含量;同时使心肌细胞自噬增强;线粒体膜电位降低,而麦冬皂苷D共处理能明显逆转上述指标。结论麦冬皂苷D对AngⅡ所诱导的心肌肥大有抑制作用。

人参皂苷Re对H9c2心肌细胞CYP450酶的影响

目的观察人参皂苷Re对H9c2心肌细胞色素P450酶的影响,旨在发现人参皂苷Re对心肌细胞作用的分子机制。方法实验分对照组、人参皂苷Re各剂量组(1、5、10、50、100μmol·L^(-1))处理组,人参皂苷Re作用6、24、36、48及60 h后提取RNA或蛋白进行测定。利用实时定量PCR法检测H9c2心肌细胞CYP2C11、CYP2J3、CYP4A1、CYP4A3、CYP4F4及ANP mRNA的表达;采用Western blot法检测心肌细胞CYP4A1和CYP2J3蛋白的表达。结果人参皂苷Re明显上调心肌细胞CYP2C11、CYP2J3 mRNA的表达至正常对照的1.6、1.8倍,明显下调CYP4A1、CYP4A3及CYP4F4 mRNA的表达至正常对照的0.4、0.15、0.3倍。人参皂苷Re明显上调ANP基因表达水平至正常对照的3.2倍。随着药物浓度的增加,人参皂苷Re对CYP4A1蛋白表达产生明显的下调作用,而对CYP2J3蛋白产生明显的上调作用。结论人参皂苷Re可影响心肌细胞的CYP450酶和ANP基因的表达。

四物汤对环磷酰胺致血虚证小鼠骨髓蛋白质组的影响

目的:研究四物汤对环磷酰胺(CTX)损伤致血虚证小鼠骨髓蛋白质组的影响,旨在分子水平上探讨四物汤促进骨髓造血的作用机制。方法:采用CTX 250 mg.kg-1腹腔注射制成化学损伤型血虚证小鼠模型,利用蛋白质组学技术研究四物汤治疗后的差异蛋白质组。结果:研究发现CTX使小鼠骨髓中12个蛋白表达上调、3个蛋白表达下调,四物汤可使CTX造模后这些表达改变的蛋白有不同程度恢复。结论:四物汤可能通过影响与细胞凋亡、造血干祖细胞增殖分化有关的蛋白质而促进骨髓造血。

复方丹参滴丸对大鼠肝细胞色素P450酶的影响

目的观察复方丹参滴丸及其单味药对大鼠肝细胞色素P450酶(CYP)主要亚型的影响。方法 SD大鼠分别ig给予复方丹参滴丸0.3258 g.kg-1,丹参0.27 g.kg-1,三七0.0528 g.kg-1和冰片0.003 g.kg-1,每天1次,连续28 d,取大鼠肝微粒体,与CYP1A2,CYP2B6,CYP2C12,CYP2C13,CYP2D2和CYP3A1特异性底物探针共孵育,用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS/MS)测定底物的代谢产物,分析CYP1A2,CYP2B6,CYP2C12,CYP2C13,CYP2D2和CYP3A1酶活性,同时用PCR方法检测cyp1a2,cyp2b1/2,cyp2c11,cyp2e1和cyp3a1 mRNA表达的变化。结果与正常对照组相比,苯巴比妥(阳性对照)对CYP2D2和CYP3A1活性有明显抑制作用,对CYP1A2,CYP2B6,CYP2C12和CYP2C13有明显诱导作用(P<0.05,P<0.01);复方丹参滴丸对CYP1A2和CYP2B6活性有明显抑制作用,对CYP2D2有诱导作用(P<0.05);丹参对CYP1A2和CYP2B6活性有明显抑制作用(P<0.05);三七对CYP1A2,CYP2B6,CYP2C13和CYP2D2活性有明显抑制作用(P<0.05);冰片明显抑制CYP1A2,CYP2B6,CYP2C12,CYP2C13和CYP2D2活性(P<0.01),且抑制强度高于复方丹参滴丸。与正常对照组相比,苯巴比妥对cyp1a2和cyp2b1/2 mRNA水平有明显诱导作用(P<0.05);复方丹参滴丸、丹参和三七对cyp1a2,cyp2b1/2,cyp2c11,cyp2e1和cyp3a1 mRNA水平无明显影响;冰片对cyp1a2,cyp2b1/2和cyp2c11 mRNA水平有明显抑制作用(P<0.05,P<0.01)。结论复方丹参滴丸中各单味药对CYP酶的影响强于全方对CYP酶的影响,其中以冰片对药物代谢酶的影响最为显著。

基于UPLC-Q-TOF/MS研究参附注射液的物质基础

目的对参附注射液中的人参皂苷和生物碱成分进行定性,并且对参附注射液中主要成分在大鼠体内的药物动力学过程进行研究。方法运用LC-MS对参附注射液中的成分进行定性,并测定大鼠血清中多种人参皂苷的浓度,计算其药动学参数。结果参附注射液中定性出16种人参皂苷成分和10种生物碱成分。人参皂苷Rd、Rg1、Rb1、Ro、Rc、Rb2的T12α分别为0.32±0.25、0.11±0.04、0.30±0.24、0.11±0.02、0.24±0.19、0.23±0.12 h,人参皂苷Rd、Rb1、Rc、Rb2的T12β分别10.25±0.39、21.31±3.64、13.95±2.56、15.06±1.54 h。结论该方法简便、灵敏、特异,适用于血清中6种人参皂苷成分的药物动力学研究;人参皂苷Rg1、Ro在大鼠体内的分布消除速度较快,Rd、Rb1、Rc、Rb2分布消除较慢。参附注射液体外、体内成分的分析为组分配伍研究建立了可靠的方法。

复方丹参方对TNF-α刺激血管平滑肌细胞影响的蛋白质组学研究

目的观察复方丹参方对TNF-α刺激血管平滑肌细胞的影响,在分子水平上探讨复方丹参方治疗动脉粥样硬化的作用机制。方法用TNF-α刺激的血管平滑肌细胞来建立体外平滑肌细胞功能失常的细胞模型。用MTT和流式细胞术测定血管平滑肌细胞的增殖活力,用双向电泳、图像分析、质谱鉴定等蛋白质组学技术测定复方丹参方对血管平滑肌细胞中有影响的蛋白质。结果复方丹参方抑制了TNF-α引起的血管平滑肌细胞的增殖,TNF-α作用血管平滑肌细胞后有16个蛋白质下调和24个蛋白质上调,复方丹参方作用血管平滑肌细胞后可使这些改变的蛋白质水平有所恢复。复方丹参方可以下调钙调蛋白依赖蛋白激酶、N-ras、基质金属蛋白酶9的水平,上调p53肿瘤抑制因子、周期素依赖激酶抑制因子p21的水平。结论复方丹参方通过抑制基质金属蛋白酶9的分泌和升高周期素依赖激酶抑制因子的水平进而抑制血管平滑肌细胞的增殖与迁移是其治疗动脉粥样硬化的可能机制。

四物汤对血虚证小鼠骨髓细胞CD34抗原表达的影响

目的探讨四物汤对60 Coγ射线或环磷酰胺诱导的血虚证小鼠骨髓细胞CD 34抗原分子表达的影响。方法用60 Coγ射线全身照射小鼠或腹腔注射环磷酰胺造成小鼠血虚证模型 ,实验分正常组、模型组、小剂量组、中剂量组、大剂量组 ,荧光标记小鼠骨髓细胞并用流式细胞仪测定CD 34+ 细胞在骨髓有核细胞中的比例 ,同时做小鼠骨髓细胞集落培养。结果与结论四物汤可促进血虚小鼠骨髓中干祖细胞增生 ,增加CD 34抗原分子的表达 。

附子对H9c2心肌细胞系线粒体的毒性作用机制

目的研究附子对H9c2心肌细胞的线粒体毒性作用与机制。方法附子水提取物6.25,12.5,25,50和100 g·L-1作用于H9c2细胞24 h,荧光染色和CCK-8法检测细胞存活率;附子水提取物6.25,12.5和25 g·L-1作用于H9c2细胞24 h,流式细胞仪检测线粒体膜电位和活性氧（ROS）生成的变化;使用相应的荧光探针,结合激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内Ca2＋、线粒体内Ca2＋以及线粒体内超氧化物水平的变化;萤火虫荧光素法检测细胞内ATP浓度变化;实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖活化受体共激活因子-1α（Pgc-1α）,Bcl-2和Bax m RNA的表达;Western蛋白印迹法检测Pgc-1α蛋白的表达。结果附子水提取物12.5~100 g·L-1作用于H9c2细胞,可显著抑制细胞活性（P〈0.05）,IC50值为47.4669 g·L-1,95%的可信限32.5997~69.1145 g·L-1。附子水提取物25 g·L-1处理后,ROS的荧光强度由正常对照组的204±67升高到454±78（P〈0.05）,线粒体超氧化物的荧光强度由5.4±1.8升高到26.8±8.5（P〈0.01）,线粒体膜电位由1.7±0.5下降到0.8±0.4（P〈0.05）,线粒体内Ca2＋的荧光强度由38.0±4.3下降到9.2±1.6（P〈0.01）,细胞内Ca2＋的荧光强度由7.8±0.8升高到22.1±0.5（P〈0.05）,细胞内ATP浓度由（10.6±0.4）μmol·g-1下降到（5.3±1.1）μmol·g-1蛋白（P〈0.05）。实时荧光定量PCR和Western蛋白印迹检测结果显示,与正常对照组相比,附子水提取物25 g·L-1组Pgc-1α和Bcl-2的m RNA表达分别由正常对照组的1.00±0.10和1.00±0.10下降到0.09±0.06（P〈0.01）和0.43±0.06（P〈0.01）,Bax m RNA表达由1.00±0.03升高到1.17±0.06（P〈0.05）;Pgc-1α蛋白表达由正常对照组的0.906±0.034下降到0.541±0.003（P〈0.01）。结论附子对心肌细胞具有一定的线粒体毒性,其作用是多种途径共同作用的结果。附子的心肌线粒体毒性可能是附子造成心肌毒性的原因。