用McAb-AST及骨髓涂片法对四川省汶川县犬感染利什曼原虫的调查研究

作者等用单克隆抗体-抗原斑点试验(McAb-AST)及骨髓穿刺涂片法对汶川县125只犬进行感染利什曼原虫调查,骨髓涂片法查出原虫的阳性犬46只,感染率为36.8％,较之历年来陇南、川北报道的犬感染率为高,不但查明了当地犬感染利什曼原虫的严重性,且为本年在白蛉繁殖季节前消除这些传染源提供了确切依据。为了研究对犬利什曼病的简易、准确的调查方法,我们同时用McAb-AST对该125只犬的血清,检测其循环抗原,结果与骨髓涂片阳性符合率为97.8％,总符合率95.2％,可望取代骨髓涂片法。

内脏利什曼病患者骨髓及血内病原体特异性kDNA片段PCR扩增用于诊断的研究

目的 :建立简易、准确的诊断内脏利什曼病和病原体鉴定技术。方法 :采用作者设计的杜氏利什曼原虫 ( L.d.)种特异引物 和 ,经 PCR扩增样品内病原体 k DNA2 97bp片段 ,检测 2 2例确诊内脏利什曼病 ( VL )患者骨髓、血、血清共 55份样品和 4例临床疑诊为黑热病患者的骨髓 (共 2 6例 ,59份样品 )。结果 :( 1) PCR法与骨髓涂片镜检符合率为 96.2 % ( 2 5/2 6) ;( 2 ) PCR法检测骨髓、血及血清的总阳性率为 95.4 % ( 2 1/2 2 ) ;( 3) PCR法检测 2 2例骨髓、 16例血样品及 17例血清样品 ,阳性率分别为 91% ( 2 0 /2 2 )、 68.8% ( 11/16)及 2 9.4 % ( 5/17)。 15例骨髓对照样品得自 9例白血病患者及 6例健康人。血及血清对照样品各得自 5例健康人。全部对照未见扩增产物 ,均为阴性。结论 :采用引物 和 进行 PCR扩增检测血内 k DNA特异片段诊断内脏利什曼病有较好前景。

应用单克隆抗体—抗原斑点试验检测血清抗原诊断黑热病的进一步研究

用单克隆抗体—抗原斑点试验(McAb-AST)又一次对50例黑热病确诊患者作血清抗原检测,以诊断黑热病。阳性率达100％。与前文报道的51例共计101例的阳性率为97.03％。509份对照血清(合计)中,假阳性反应1例(0.2％),特异性达99.8％。本文新病例乃在改进及简化方法基础上获得了更满意的效果。分析甘肃陇南、四川北部63例患者的年龄分布可见:10岁以下占65.1％;11—20岁,12.7％;21—30岁, 17.4％;21—40岁,4.8％;40岁以上无病例。符合山丘型黑热病的特点。本文总结出McAb—AST为敏感性高(97.03％),特异性强(99.8％)的黑热病实验断方法。经简化后,适合于广大基层单位推广使用,由于所需血清样品量微,取材方便,在儿童多发的山丘型黑热病疫区的应用,较之骨髓涂片诊断法的优越性,更显而易见。

用McAb—AST对黑热病患者疗效考核的进一步研究

用单克隆抗体一抗原斑点试验(McAb—AST)对我国山丘疫区27例(32人次)黑热病患者在斯锑黑克治疗前、后检测循环抗原作了对比观察,以考核疗效。其中25例治前骨髓涂片查见病原体,2例骨髓片漏诊。32人次治疗前MeAb—AST均显阳性反应。一个疗程后McAb—AST转为阴性的16人次,临床表现为痊愈,McAb—AST仍为阳性反应的9例,临床表现也未愈;余7人次McAb—AST与临床症状均有一定程度好转。本法显示的结果与患者病情的归转状况及病原体的查获与否是相吻合的。表明McAb—AST可用于黑热病治后近期疗效考核,且可弥补骨髓涂片的漏诊。

抗杜氏利什曼原虫保护性单克隆抗体研究

作者用~3H-胸腺嘧啶核苷掺入法筛选出的3株单克隆抗体(McAb)对L.d.前鞭毛体具有抑制作用,并以2B12-A8及2H6-E3作用最强,在补体协同作用下,其抑制率稳定在94～99.3％的优异水平。而1B1-C2加补体的抑制率波动于68～95％.用McAb 1B1-C2对L.d.同株前鞭毛体分别进行~3H-胸腺嘧啶核苷掺入法及巨噬细胞吞噬抑制试验,两法所得抑制率极为相近,分别为68～95％及61～87％。经免疫金技术超微定位证实,抑制作用最强的McAb 2H6-E3识别的抗原较广泛地存在于前鞭毛体膜外沿。此保护性McAb的发现,为黑热病免疫预防的研究提供了重要基础。

用MCAb-AST对山丘疫区黑热病漏诊的实验诊断研究

本文报道McAb-AST法对我国山丘疫区骨髓涂片检查漏诊的黑热病病例实验诊断价值。观察的81例中骨髓涂片法漏诊者有13例,经McAb-AST显阳性反应,而给予锑剂治疗,治后11例临床痊愈,用McAb-AST复查者也转为阴性反应(1例复发除外),从而表明骨髓涂片法漏诊率高达16.05％,而McAb—AST显假阴性反应者仅有1例(1.23％)。本文还对McAb-AST的实验条件进行了改进,并以实验结果论证了McAb-AST阳性反应系由于特异性McAb-与循环抗原的结合,而不是非特异性反应所致。

杂交瘤细胞在玻璃微载体培养中生物特性观察

本文报道以玻璃微载体小珠(CMB,Class microcarrier beads)作为载体培养杂交瘤细胞方法的建立。结果表明4株杂交瘤细胞在GMB培养显示GNB法上清中特异性单克隆抗体的滴度。OD值较单层培养法为高。比较培养7d后的杂交瘤细胞数,也以GMB法获得细胞数为多。各株细胞都诱生出高滴度腹水。亚类鉴定方面,GMB法培养的4株杂交瘤细胞上清内McAb所属亚类,又都保持了与单层法培养者完全相同的结果。表明杂交瘤细胞在CMB培养中,细胞迅速增殖,且保持各细胞株分泌其特异的McAb的生物特性,细胞活力旺盛,为今后体外培养杂交瘤细胞,制备McAb,提供了新的途径。

黑热病患者尿中循环抗原的检测及识别抗原分子的研究

“致死性疾病”在苏丹蔓延。我国黑热病亦回升。急迫需要建立新的、对病人无损伤的诊断方法。作者等已建立用血清ＭｃＡｂ－ＡＳＴ诊断黑热病的方法。本文报道用同法检测病人尿中循环抗原的结果。对１７例确诊黑热病患者尿液的检测，１６例呈阳性反应，阳性率９４％。正常人对照３０例均呈阴性结果。１５／１５例黑热病息者血清ＭｃＡｂ－ＡＳＴ显阳性。同一病倒尿样、血清反应的阳性程度相近。取尿液较之任何采样途经都更为简便，特别是对婴幼儿发病率高的山丘疫区，更为适合。免疫印迹法显示识别出二条特异区带。其分子量分别为４５ｋＤ和２２ｋＤ。进一步鉴定出黑热病患者尿中的Ｌ．ｄ抗原。系国内外首次报道。

杜氏利什曼原虫cDNA文库的构建

目的 :建立杜氏利什曼原虫 c DNA文库 ,以获取个体基因表达产物和研究基因结构。方法 :以杜氏利什曼原虫四川人分离株 m RNA为模板 ,体外合成 c DNA,以噬菌体λgt11DNA为载体构建文库。结果 :共获 2× 10 6重组子 ,插入比例为 4 8%。文库经抗杜氏利什曼原虫前鞭毛体全虫兔抗血清筛选 ,共筛 2× 10 4重组子 ,获 3个阳性表达克隆 ,表达产物的分子量分别为 :136k Da、160 k Da和 148k Da。结论 :已构建成的表达型杜氏利什曼原虫 c DNA文库 ,其插入比例和表达效率均较高。

双氢青蒿素对杜氏利什曼原虫前鞭毛体作用体外实验研究

观察双氢青蒿素在不同浓度、不同时间对杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄ）汶川株及Ｌ．ｄ山东株前鞭毛体的体外作用。采用镜下观察及胸腺嘧啶核苷（３Ｈ－ＴｄＲ）掺入试验。结果：（１）镜下观察：实验组３个不同浓度（１４．１×１０－４ｍｏｌ／Ｌ、７．１×１０－４ｍｏｌ／Ｌ、３．５３×１０－４ｍｏｌ／Ｌ）的药物作用４８ｈ后，培养基颜色未变（红），虫体活动变慢以至几乎不动，虫数减少，抑制率升高（Ｌ．ｄ汶川株的抑制率由７３％升至８６％，Ｌ．ｄ山东株由６９．４％升至９７．５％），染色后见虫体变形，核、动基体不完整，胞质内出现多个空泡，鞭毛脱落。对照组的培养基颜色变黄，虫体活跃，大部分呈长梭形，并排成菊花状。染色后虫体呈长梭形，核、动基体、鞭毛、胞膜完整、清晰。（２）３Ｈ－ＴｄＲ掺入试验：双氢青蒿素在３．５３×１０－４ｍｏｌ／Ｌ２４ｈ即对两株有抑制作用（Ｌ．ｄ汶川株抑制率６５．８％，山东株为９３．４％）。但随着药物浓度的升高，作用时间的延长，抑制作用没有明显变化（Ｐ＞０．０５）。对Ｌ．ｄ山东株的抑制作用较Ｌ．ｄ汶川株为强。本文为首次报道双氢青蒿素对杜氏利什曼原虫具有较强的体外抑制作用。

我国内脏利什曼病山丘疫区与平原疫区利什曼原虫SSUrDNA多变区序列分析

[目的 ]分析我国内脏利什曼病 (VL)山丘疫区与平原疫区利什曼原虫 (L .d )分离株小亚基核糖体DNA (SSUrDNA)多变区的序列差异。 [方法 ]nDNA进行PCR扩增 ,将扩增出的SSUrDNA基因的特异片段克隆于 pGEMR TEasyVector上 ,采用通用引物M 13进行PCR扩增 ,全自动测序仪测序。 [结果 ]序列分析显示 ,扩增的 5株利什曼原虫SSUrDNA序列大小均为 392bp ;序列差异均发生在两个独特序列区 (UQ Ⅰ和UQ Ⅱ ) ;山丘疫区L .d甘肃分离株和四川分离株均在UQ Ⅱ区上有 2个相同的碱基突变 ,L .d甘肃分离株UQ Ⅰ区上有 1个碱基突变 ;无移码突变。 [结论 ]山丘疫区分离株与平原疫区分离株之间的碱基序列有差异 ,平原疫区L .d山东分离株与婴儿利什曼原虫 (L .infantum)

我国山丘疫区与平原疫区利什曼原虫分离株分子核型分析

目的：分析我国山丘疫区和平原疫区利什曼原虫分离株分子核型。方法：脉冲场电泳。采用１％琼脂糖凝胶，电压６Ｖ／ｃｍ，０．５×ＴＢＥ，１４℃，脉冲时间６０ｓ，电泳１５ｈ和脉冲时间９０ｓ，电泳９ｈ。结果：各个分离株均分离出分子量范围在２００ｋｂ－２２００ｋｂ的ＥＢ染色条带为１５条左右，其中６个山丘疫区分离株之间的核型相似，且犬株与人株的亦相似，并与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ的核型接近；２个平原疫区分离株之间的核型相似；山丘疫区与平原疫区分离株之间的核型不同。结论：山丘疫区分离株之间和平原疫区分离株之间均各自存在着同源性，山丘疫区分离株与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ之间存有部分同源性，但两个疫区分离株之间存在着异源性；保虫宿主——家犬，是我国山丘疫区内脏利什曼病的重要传染源。

我国不同流行区内脏利什曼原虫分离株kDNA的PCR-SSCP分析

目的： 分析我国不同类型流行区内脏利什曼原虫 （Ｌ．ｄ．） 分离株ｋＤＮＡ。方法： 应用利什曼原虫属特异引物１３Ａ， １３Ｂ及据杜氏利什曼原虫四川人分离株ｋＤＮＡ 微环特异片段序列设计合成的引物Ⅰ、引物Ⅱ， ＰＣＲ扩增不同流行区利什曼原虫分离株ｋＤＮＡ， 获特定片段， 进行ＳＳＣＰ分析。结果： 用引物Ⅰ和引物ⅡＰＣＲ扩增内脏利什曼原虫分离株ｋＤＮＡ， 在同样试验条件下， 山丘地区和荒漠地区Ｌ．ｄ． 分离株扩增出２９７ ｂｐ 特定片段， 而平原地区Ｌ．ｄ．分离株及新疆皮肤利什曼原虫未扩增出２９７ ｂｐ 特定片段。将上述各虫株的２９７ ｂｐ 特定片段进行ＳＳＣＰ分析， 可见两个山丘地区的Ｌ．ｄ．分离株ｓｓＤＮＡ 迁移率相同， 而与荒漠地区新疆７７１分离株则相差较大。用引物１３Ａ， １３ＢＰＣＲ 扩增平原地区的Ｌ．ｄ．山东分离株和Ｌ．ｄ．江苏分离株、山丘地区的Ｌ．ｄ．汶川分离株、Ｌ．ｄ．甘肃分离株，均扩增出１２０ ｂｐ 特定片段。经ＳＳＣＰ分析，平原地区的Ｌ．ｄ．山东分离株和Ｌ．ｄ．江苏分离株的ｓｓＤＮＡ迁移率完全相同； 山丘地区的Ｌ．ｄ．汶川分离株和Ｌ．ｄ． 甘肃分离株ｓｓＤＮＡ迁移率相同， 但与平原地区者明显不同；

杜氏利什曼原虫平原和荒漠疫区分离株LACK基因克隆及序列分析

目的 测定我国平原疫区和荒漠疫区杜氏利什曼原虫分离株活性蛋白激酶 C受体同源物 (L ACK)基因序列 ,并与山丘疫区分离株及国外利什曼原虫分离株进行比较。 方法 应用 RT- PCR扩增 L ACK基因 ,将其克隆入p UC18载体后用双脱氧链末端终止法测序 ,并与 Gen Bank中相关数据进行比较。 结果 用 RT- PCR成功扩增出约95 0 bp的 L ACK基因片段 ,测序结果表明其片段大小均为 94 2 bp,与 Gen Bank中多种利什曼原虫 L ACK基因的核苷酸序列一致性达 97%以上。我国山丘、平原和荒漠 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因序列的一致性达95 %以上。 结论 获得了我国平原和荒漠疫区杜氏利什曼原虫 L ACK基因序列。我国 3个不同疫区杜氏利什曼原虫分离株的 L ACK基因具有高度同源性。

双氢青蒿素治疗鼠内脏利什曼病疗效的初步观察

目的 观察双氢青蒿素治疗由杜氏利什曼原虫感染引起的鼠内脏利什曼病的疗效。方法 以杜氏利什曼原虫无鞭毛体腹腔感染金地鼠 ,两周后分为小剂量治疗组 (n=5 )、大剂量治疗组 (n=5 )及对照组 (n=5 ) 3组开始治疗。小剂量治疗组每天每只给予双氢青蒿素 2 5 m g/ kg,大剂量治疗组每天每只 5 0 mg/ kg,对照组给予植物油 ,口服途径给药 ,每天一次 ,3组均持续治疗 14 d。治疗结束后 7d剖杀 3组金地鼠 ,通过有限稀释法及 L DU计数法计算各鼠肝、脾内寄生的虫数。结果 双氢青蒿素小剂量治疗组及大剂量治疗组治疗鼠内脏利什曼病的有效率均为 80 % ;有限稀释法显示 ,小剂量治疗组的脾脏抑虫率为 79.11% ,肝脏抑虫率为 86 .2 1% ;大剂量治疗组的脾脏抑虫率为 83.77% ,肝脏抑虫率为 87.13%。L DU计数法获得的结果与有限稀释法的结果具有很好的一致性。大剂量组与小剂量组脾脏和肝脏的抑虫率均无显著性差异。

用RAPD技术对利什曼原虫kDNA、nDNA的分析

目的 :用RAPD技术分析利什曼原虫的kDNA及nDNA。方法 :用 7种随机引物扩增L .infantum和L .donovaniGS2的kDNA和nDNA ,分析扩增结果并计算两虫种间kDNA和nDNA共享度F值。结果 :7种随机引物对两虫种的kDNA、nDNA均扩增出各自特有带型。L .infantum和L .donovaniGS2两虫种间kD NA、nDNA扩增片段的F值分别为 0 2 2 7和 0 2。结论 :kDNA和nDNA均可作为利什曼原虫的RAPD扩增模板 ,这 7种引物均可用于对L .infantum和L .donovaniGS2进行RAPD分析。该两虫种kDNA、nDNA的共享度较低 ,说明二者遗传距离较远。在进行RAPD分析时 ,提取全DNA (包括kDNA和nDNA)

热休克蛋白70(hsp70)基因对利什曼原虫中国分离株的系统发育分析

目的选用hsp70基因探讨我国各疫区不同宿主利什曼原虫的种系发育关系。方法采用PCR方法扩增分离自中国各疫区不同宿主的利什曼原虫之热休克蛋白70(hsp70)基因,将扩增的目的片段纯化后测序。使用MEGA 5.0软件对测序产物进行多序列比对并构建系统发育树,同时与国外利什曼原虫分离株的hsp70序列共同分析,观察利什曼原虫中国分离株在世界范围利什曼原虫的系统发育和分子进化中的地位。结果中国各流行疫区利什曼原虫均获得约1 300bp长度的hsp70基因片段,存在丰富的多态位点。中国23株利什曼原虫经hsp70基因分型聚集为四群,其中人来源的原虫分离株均在A群,为杜氏利什曼原虫(L.donovani),并分为杜氏利什曼原虫指名亚种(L.donovani)和杜氏利什曼原虫婴儿亚种(L.infantum)两个亚支;分离自新疆沙鼠或白蛉的6株利什曼原虫聚在B群,为都兰利什曼原虫(L.turanica);分离自新疆白蛉和内蒙古沙鼠的两株利什曼原虫为C群沙鼠利什曼原虫(L.gerbilli);分离自内蒙古蜥蜴和新疆白蛉的两株原虫为D群蜥蜴利什曼原虫(Sauroleishmania)。结论利什曼原虫中国分离株属于利什曼原虫亚属的不同种和蜥蜴利什曼原虫亚属,我国利什曼原虫分离株的种系发育复杂多样。

山丘疫区杜氏利什曼原虫核糖体基因内转录间隔区的克隆及序列分析

目的 构建我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株前鞭体核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区 (ITS)片段克隆 ,并进行测序及同源性分析。 方法 提取杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA进行PCR扩增 ,将扩增出rDNAITS片段克隆入pMD18 Tvector上 ,双脱氧链末端终止法测序。 结果 扩增出约 10 0 0bp的rDNAITS片段。测序结果表明山丘疫区的2株利什曼原虫L .d .SC10和L .d .6分别为 10 2 7bp和 10 2 8bp。序列分析结果表明 ,L .d .SC10和L .d .6有一定差异。 结论 获得了我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株L .d .SC10和L .d .6的前鞭体rDNAITS序列。

我国山丘疫区杜氏利什曼原虫LACK保护性抗原基因克隆和序列分析

利什曼原虫的LACK抗原是利什曼原虫的蛋白激酶C受体的同源物 ,是新发现的一种抗原蛋白。本实验用分子克隆的方法获得我国山丘疫区杜氏利什曼原虫编码LACK保护性抗原的基因片段 ,测序并对其序列分析比较。我国山丘疫区杜氏利什曼原虫 (L dSC10 )LACK抗原基因片段的大小为 94 2bp ,与GenBank中LACK的核苷酸序列一致性在 94 %以上 ,呈高度同源性 ;推导的氨基酸序列与GenBank中LACK的氨基酸序列一致性达 95 %以上 ,具有高度保守性 ;该蛋白质属于WD蛋白家族 ,有重要的生物学意义。

杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒的免疫原性研究

目的研究杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin的免疫原性。方法将18只雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组9只。两组分别肌肉注射重组质粒pcDNA3.1-amastin和空质粒pcDNA3.1(+)(50μg/只),2周后同法加强免疫1次。加强免疫后第7、14和21天每组各取小鼠3只,内眦采血,分离血清,间接ELISA法测定血清中抗原特异性抗体水平。随后脱颈处死小鼠,无菌取脾,分离脾细胞,用刀豆球蛋白A刺激培养,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测脾淋巴细胞增殖活性和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和IL-4的水平。结果加强免疫后第7、14和21天,实验组均检测到特异性IgG抗体,效价在1∶640以上,而对照组未检测到IgG抗体(P<0.01);实验组脾淋巴细胞增殖活性刺激指数分别为4.28±0.51、5.01±0.60和4.39±0.50,均高于对照组(P<0.01);实验组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ含量分别为(42.06±4.26)、(66.02±6.02)和(58.29±3.75)pg/ml,IL-2含量分别为(38.21±5.11)、(64.79±8.67)和(52.69±7.15)pg/ml,均高于对照组(P<0.01),两组均未检测到IL-4;实验组脾淋巴细胞CTL杀伤活性分别为(42.20±5.96)%、(63.66±5.44)%和(52.24±4.56)%,均高于对照组(P<0.01)。结论杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因重组质粒pcDNA3.1-amastin免疫小鼠后可诱导其产生特异的体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答。