大片吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆表达和免疫原性分析

磷酸丙糖异构酶(TPI)是生物体糖酵解的一种关键酶,对大片吸虫获取能量而赖以生存有着十分重要的作用。本试验根据肝片吸虫TPI(GenBank:KC164346.1)的基因序列,设计带有BamHⅠ和XhoⅠ作为酶切位点的引物,以大片吸虫的cDNA为模板,扩增大片吸虫磷酸丙糖异构酶(FgTPI)基因。结果:FgTPI基因开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸,理论等电点pI为8.07;构建的重组表达质粒FgTPI-pET-28a(+)成功在大肠杆菌中表达,重组蛋白的分子量约为32 kDa;重组蛋白免疫BALB/c小鼠,收取多克隆抗体,ELISA检测结果显示,rFgTPI能诱导较高的IgG抗体水平;用感染大片吸虫动物的血清检测重组蛋白的免疫原性,Western blot分析表明,重组蛋白rFgTPI具有良好的免疫原性;生物信息学预测显示,FgTPI主要以α螺旋和β折叠为主,β转角较少,有3个较长的无规则卷曲;通过α-磷酸甘油脱氢酶偶联法测定其活性,发现FgTPI酶促反应最佳pH值为7.5,最适温度为35℃。本试验结果为深入研究FgTPI的生物学功能、评价其作为抗大片吸虫病疫苗候选分子奠定了基础。

血清14型副猪嗜血杆菌的分离与多克隆抗体制备

【目的】探明引起猪副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)病发病的病原菌,并制备分离病原菌的多克隆抗体,为该病的治疗及疫苗的研发提供技术支撑。【方法】从送检病料分离出保育猪发病病原菌,并对其进行形态观察、生化鉴定与PCR鉴定,明确分离病原菌的类型及血清型;同时使用甲醛对分离病原菌进行灭活后再与弗氏佐剂乳化制备灭活菌体抗原,经肌肉和皮下免疫BALB/C小鼠,制备该分离病原菌的鼠源多克隆抗体;采用饱和硫酸铵沉淀法对制备的多克隆抗体进行纯化,利用SDS-PAGE方法鉴定纯化抗体的纯度,通过免疫荧光进一步检测抗体与抗原的结合效果。【结果】从病料中分离得到1株革兰氏阴性短小杆菌,经形态学观察、生化鉴定与PCR鉴定,分离到的病原菌为血清14型副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS);灭活后的HPS与佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠制备得到分离病原菌的多克隆抗体,阳性菌液与纯化后稀释500倍和2000倍的多克隆抗体结合并加入荧光二抗后于显微镜下观察,病原菌发出红色荧光;经Western blot检测,制备多克隆抗体在约13 ku、30 ku和50 ku处有3条清晰条带,Western blot和免疫荧光试验均证实制备的多克隆抗体可与分离病原菌发生特异性反应。【结论】制备的血清14型HPS多克隆抗体可与分离病原菌发生特异性反应。

中国猪瘟C-株(脾淋毒)全长cDNA的分子克隆

应用RT PCR、NestedPCR和Half nestedPCR技术从实验感染兔脾组织的总RNA中得到了覆盖猪瘟病毒(CSFV)C 株全基因组的7个cDNA重叠片段,分别克隆于pMD18 T或pGEM TEasy载体后进行测序。运用T A克隆和多片段一步连接法,将cDNA重叠片段F1、F2、F3、F4与F5、F6、F7分别克隆到pGEM 5Zf(+)载体后,得到两个半长cDNA亚克隆重组质粒pGEM 5Zf(+)/F1 4和pGEM 5Zf(+)/F5 7,再将两个半长cDNA重叠片段连接并克隆到pGEM 5Zf(+)载体,构建出了CSFVC 株全长cDNA重组质粒pGEM 5Zf(+)/F1 7。全长cDNA的成功构建为进一步研究CSFV分子生物学提供了良好的工具。

猪瘟病毒兔化弱毒株全长cDNA克隆的感染性鉴定

用SrfⅠ限制性内切酶将构建的猪瘟病毒兔化弱毒株(C 株)全长cDNA线性化,体外转录获得其基因组RNA,利用脂质体将基因组RNA转染至SK 6细胞系,连续传代,收集5代以后培养细胞,采用RT PCR、荧光抗体直接法、夹心ELISA进行鉴定。结果表明,所构建的全长cDNA具有感染性。猪瘟病毒C 株全长感染性cDNA的成功构建,为在分子水平上进一步研究中国猪瘟病毒兔化弱毒株提供了极有价值的研究工具。

一种鉴别猪瘟C-株和其他毒株的分子生物学方法

根据已发表的猪瘟病毒(CSFV)核苷酸序列,筛选出C-株与其他毒株的核苷酸序列差异标记CTTTTTTCTTTT,并设计包含此标记序列的CSFV特异性PCR引物对及nested-PCR引物对。从待检猪脾脏或淋巴组织中提取总RNA,用AMV逆转录酶进行逆转录后,进行PCR和nested-PCR。将扩增片段纯化回收并克隆到pMD18-T载体进行测序。对测序结果进行分析,含有此标记序列的即为C-株,不含此标记序列的则为其他毒株。

猪瘟强弱毒鉴别多重RT-PCR方法的建立及应用

【目的】建立一种能够应用于临床样本猪瘟病毒(CSFV)检测的快速、简便且标准化程度高的检测技术,以满足畜牧业生产和兽药市场的需求。【方法】根据GenBank中猪瘟病毒及近源病毒的基因组全序列,选择特异保守区域设计了2对猪瘟病毒引物,借助3′端引物碱基错配对PCR扩增效率的影响,优化筛选了能够鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒疫苗的PCR退火温度,经多重试验组合建立了一套鉴别猪瘟强毒和弱毒的多重RT-PCR鉴别诊断方法。【结果】扩增反应条件的确定试验表明,退火温度为55℃;特异性分析表明,从弱毒C株和石门强毒株的基因组中分别扩增出1条大小为492和178 bp的特异性片段,从强弱毒株混合物中1次扩增出2条大小为492和178 bp的特异性片段,检测不到伪狂犬病病毒的RNA;敏感性分析表明,该方法能检测出0.8 pg的猪瘟病毒RNA;应用试验表明,8份疑似猪瘟病料中5份为强毒感染,2份为弱毒感染,1份为弱毒和强毒的混合感染。【结论】研究建立的多重RT-PCR方法具有敏感性、特异性强、重复性好的特点,对养猪业的发展具有十分重要的意义。

猪瘟病毒的分子生物学研究进展

本文概述了猪瘟病毒的基因结构和功能 ,猪瘟的分子生物学诊断技术和基因疫苗 ,以及猪瘟病毒全长感染性 c DNA的研究进展。为进一步研究猪瘟病毒的复制机理、毒力及其决定因素、致弱机理、致病机理、基因产物的功能、宿主嗜性及标记疫苗的开发提供理论参考。

禽流感病毒新型疫苗的研究进展

疫苗免疫是禽流感防控的主要措施之一,随着生物技术的不断发展,基因工程亚单位疫苗、活载体疫苗、DNA疫苗等新型疫苗得以研究和开发,这为禽流感的防控提供了新的手段。新型疫苗除具有传统疫苗的保护效果外,在生物安全和普遍防控等方面也具有广泛的优势,是禽流感疫苗发展的新方向。

中国猪瘟兔化弱毒(脾淋毒)基因组5′-UTR的克隆和二级结构分析

据已发表的 CSFV C-株序列 ,设计合成了 5′- UTR特异性 PCR引物对 P1- N 1及半套式下游引物N1′。从兔脾组织中提取总 RNA,应用 RT- PCR及 Half- nested PCR成功地扩增出了 CSFV5′- U TR,进一步将该片段克隆到 p MD- 18T载体质粒并进行了序列测定。与 Shimen株、AL D株、GPE-株、Holland C-株和 Russian C-株相应区段的比较分析表明 ,其同源性分别为 96 .2 %,95 .7%,96 .0 %,98.7%和 95 .4 %。 5′- U TR中发现的隐性 AUG起始密码子及茎环二级结构 ,可能在多聚蛋白前体的翻译以及病毒的复制中起着重要作用。

牛红细胞源抗菌肽的分离纯化与活性鉴定

【目的】分离纯化牛红细胞中的抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs),并对其体外抗菌活性进行初步检测。【方法】以中国荷斯坦奶牛血液为材料,通过离子交换层析法和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)纯化抗菌肽,用琼脂糖平板扩散法测定其抗菌活性,并用质谱法测定其分子质量。【结果】牛血液红细胞粗提物经离子交换层析获得的阳离子峰有抗菌活性;阳离子峰经RP-HPLC纯化后,共得到4个峰(F1、F2、F3和F4),其对大肠杆菌均具有抗菌活性,F1峰和F3峰对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,仅F1峰对白色念珠菌具有抗菌活性;经质谱分析,F1峰纯化肽的分子质量为2 562.40 u。【结论】成功地从牛红细胞中分离纯化到了AMPs;F1峰中AMPs的抗菌谱较广,抗菌活性较强。

禽流感病毒HA及NA基因序列比较分析

从GenBank数据库下载世界各地分离的禽流感病毒血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因组序列及其对应的氨基酸序列并对其进行多重比对分析,绘制系统进化树.结果发现来自同一国家或地区的AIV毒株HA基因和NA基因亲缘关系较近.相同亚型的不同毒株之间,HA和NA基因相对比较保守序列的同源性在90%以上.从下载的HA和NA基因数量来看.报道较多的是H5亚型和N1亚型序列.此外.在数据处理过程中通过自编程序结合互联网及免费软件,能迅速进行大规模序列比较分析(20个序列以上),提高了生物数据分析处理的速度.禽流感病毒HA及NA基因序列比较及变异规律分析,将为本病的防制提供一定的理论参考.

RTP-CR和nested-PCR技术在猪瘟病毒检测中的应用

根据已发表的CSFV核苷酸序列 ,设计并合成CSFV特异性PCR引物对及nested PCR引物对。从待检猪脾脏、淋巴组织或实验感染的细胞培养物中提取总RNA ,用AMV反转录酶进行反转录后 ,进行PCR扩增 ,一扩产物再用nested PCR引物对进行二次扩增 ,用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。进一步将该片段纯化回收后 ,克隆到T载体并进行测序。测序结果同已知的CSFV、BVDV和BDV核苷酸序列进行同源性比较分析 ,既可快速、准确地区别于BVDV和BDV ,又可以确定CSFV的血清型。该方法可有效用于猪瘟的病理学和流行病学研究。

集约化猪场仔猪黄白痢的综合防治

仔猪黄白痢是由埃希氏菌属(Escherichia)中的一些大肠埃希氏菌(E.coli)条件性致病菌株所引起的细菌性传染病。致病性大肠杆菌通常只有在肠道内环境改变或其他诱激因素的作用下,可以在肠道内大量繁殖,导致下痢。仔猪黄白痢的发生主要由致病性大肠杆菌引起。其中黄痢多发生于7日龄以内仔猪,病猪主要表现为排黄色或黄白色稀粪,黄痢病猪抗过7天以后症状逐渐转化为白痢症状。近年来。

应用RT-PCR技术诊断鸡传染性支气管炎

根据已发表的IBV4/91attenuated株S1基因序列,设计并合成了产物约600bp的IBV特异性PCR引物对。从可疑病鸡气管、肺脏或肾脏组织中提取总RNA,用AMV反转录酶反转录后,再进行PCR扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小。采用NDV和IBDV病料组织作阴性对照,IBV标准株M41作阳性对照。该法检测特异性强、成本低、检出率高,可有效用于鸡传染性支气管炎的早期检测和流行病学研究。

SARS-Cov的结构及其分子生物学特征

本文综述了SARS-Cov的结构、基因组特征以及预测编码蛋白的结构和功能分析,以期为目前正在从事SARS-Cov分子生物学研究的科研人员提供一定的参考。

鸡传染性喉气管炎(AILT)油乳剂灭活疫苗的制备及应用

20世纪90年代以来,豫北地区间歇性地暴发了鸡传染性喉气管炎(AILT)。由于传统的弱毒疫苗毒性较强,尤其是对雏鸡,免疫后出现一定的发病率。因此,我们从发病鸡分离到了当地的强毒,经提纯后,制备了油乳剂灭活苗。经使用,其保护率和安全性均优于市售弱毒疫苗,有效地预防和控制了该病的发生和流行。

1株天然抗菌肽的纯化及活性检测

从牛血液中制备血红蛋白粗提物,运用离子交换层析和反相高压液相色谱法纯化抗菌肽,用琼脂糖弥散法测定其抗菌活性。结果表明:通过离子交换层析获得的阳离子峰具有抗菌活性,通过反相高效液相色谱对阳离子峰进行分离,获得6个峰,其中F1、F2、F4和F6峰对大肠杆菌具有活性,F1、F2和F6对金黄色葡萄球菌具有活性,仅F2对白色念珠菌具有活性,表明F2抗菌肽具有较为广谱的抗菌活性。

重组H5N1亚型禽流感病毒NA基因腺病毒的滴度测定及遗传稳定性研究

为了研究表达H5N1亚型禽流感病毒NA基因重组腺病毒pAd-N1的遗传稳定性及重组病毒的滴度,将重组腺病毒pAd-N1在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15、20代的重组病毒,采用PCR方法扩增禽流感病毒NA基因,并进行基因序列分析;用绿色荧光蛋白做标记计算出20代次时重组病毒的滴度。结果显示:从各代重组病毒DNA中均扩增出了约1 400 bp的目的条带,序列分析结果表明,第5、10、15代重组病毒中的NA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有2处发生了点突变(516位A→G,1 323位T→C),但其编码的氨基酸未发生变化,即蛋白抗原表位未发生变化;采用快速测定法计算出重组腺病毒的滴度为109.5pfu/mL。