人血管能抑素基因的克隆、表达及其表达产物的纯化和生物活性测定

以人胎盘脐带组织为材料 ,提取组织总RNA ,用net RT PCR方法合成人血管能抑素cDNA基因 ,将该cDNA克隆进pSP72载体获得重组质粒pSP72C ,DNA序列分析结果与预期序列一致。用BamHⅠ和NdeⅠ双酶切 ,切下pSP72C上的血管能抑素cDNA ,插入pET 3c载体的相应位点获得重组表达质粒pETC ,转化E .coliBL2 1 (DE3 ) ,SDS PAGE分析显示 :在IPTG诱导下 ,血管能抑素基因获得了高效表达 ,表达量约占菌体总蛋白的 2 7 9% ,主要以包涵体形式存在。包涵体经过洗涤、裂解、蛋白复性以及SephadexG 75凝胶过滤层析等步骤后 ,获得了纯度达 91 4%的人血管能抑素。CAM实验证明 1 0 μg纯化蛋白就能显著抑制鸡胚新生血管生成。

钙网蛋白122～180片段基因克隆、表达和活性分析

钙网蛋白是高等动物细胞中普遍存在的一种钙结合蛋白 ,近年发现它及其N端 1～ 180位氨基酸能抑制内皮细胞生长和血管生成 .为了寻找高效和小分子质量的血管生成抑制因子 ,用PCR技术扩增出钙网蛋白N端12 2～ 180位氨基酸的DNA序列 ,克隆进原核表达载体pET 3c ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导后 ,该片段以包涵体形式表达 ,表达量约占菌体总蛋白的 35 4 % .包涵体经变性溶解、复性和初步纯化后 ,纯化产物可以抑制人脐静脉内皮细胞的生长 ,鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成和小鼠原位黑色素瘤的生长 .

中国广东地区肺结核HLA-DRB1*040101-44易感基因启动子序列研究

目的分析中国广东地区肺结核患者HLA-DR易感基因启动子序列,以期了解HLA与广东地区人群肺结核发病的关联机制,探寻肺结核的发病机理。方法利用核苷酸数据库检索HLADRB1*040101-44易感基因启动子序列,依据启动子区保守序列,设计特异引物对启动子区序列进行PCR扩增,回收特异的PCR产物条带测序,对比结核病组和正常对照组、上述2组分别与网络核苷酸数据库公布的HLA-DR易感基因启动子序列。结果PCR扩增产物测序发现结核病组和对照组DRB1*040101-44启动子区序列一致,但对照组启动子序列与数据库检索序列相比有Y元件盒的变异:-166位的T被A替代,-150位的C被G替代,-137位的T被G替代,-121位的C被G替代,-98位的T被C替代,-73位的A被G替代;在-93到-88位的TATA框、-130到-125位的CAAT框以及-189到-179位的X元件盒中没有碱基变异。结论HLA-DRB1启动子区存在变异,其核酸变异发生在Y元件盒中,但此变异与中国广东地区人群肺结核发病无关联。

RAPD扩增分枝杆菌DNA优化条件及菌型分型的诊断应用

目的探讨随机扩增多态性DNA(RandomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术在分枝杆菌分型诊断中优化条件及其应用价值。方法优化RAPD技术扩增分枝杆菌DNA的条件,并分别扩增深圳市临床病人分离株DNA,对比RAPD电泳条带特征。结果以条带稳定、丰富、清晰为标准,确定引物1RAPD最佳反应条件为50μl反应体系中,含100ng模板DNA,2.5mmol/LMgCl2,2UDNA聚合酶,引物0.5μmol/L,dATP、dGTP、dCTP和dTTP各250μmol/L,反应40个循环,每个循环为94℃1min,36℃1min,72℃2min。所扩增结核杆菌临床分离株的DNA条带丰富、清晰,各条带差异较明显。结论RAPD技术能较好地鉴别MTB和NTM。

HLA-DR和HLA-DQ基因型和单倍型在深圳地区结核病发病机制中的作用

目的探讨HLA-DR和HLA-DQ单倍型在深圳地区结核病发病机制中的作用及机制。方法采用PCR-SSP技术对146例深圳地区肺结核患者及146例健康志愿者的HLA-DR的31个等位基因和HLA-DQ基因的8个等位基因行分型,比较两组间各等位基因频率(GF)和单倍型频率(HF)并计算其优势比(OR)。结果肺结核组DRB1*1601-1605/1607-1608、DRB1*040101-44位点的基因频率显著高于对照组(P均<0.05),其GF比和OR分别为14.39%vs8.59%、19.33%vs10.86%、1.85vs2.08;DR4-DRB4和DR16-DRB5单倍型频率在两组人群间有显著差异,肺结核组明显高于对照组(P均<0.05),其OR分别为2.35,2.97。结论DR4-DRB4和DR16-DRB5单倍型频率在两组人群间的显著差异可能分别是由DRB1*040101-44(DR4)和DRB1*1601-1605/1607-1608(DR16)在两组间的显著差异造成,后两者可能是深圳地区结核病发病的易感基因。

电喷雾-差分电迁移率-粒子计数法绝对定量分析牛血清白蛋白

建立了基于电喷雾-差分电迁移率-粒子计数的蛋白定量分析方法,通过优化电喷雾电压、液体溶液流速以及气体流速等参数,对牛血清白蛋白标准物质进行了定量分析。结果表明,在泰勒锥状态下,样品溶液流速300 nL/min,空气流速1.0 L/min,二氧化碳流速0.1 L/min的条件下,可以实现牛血清白蛋白标准物质和溶液标准物质的准确定量分析,测定结果为分别为20.05 g/L和69.52 g/L,与标准物质定量值的相对误差在±5%以内。该方法快速准确、灵敏度高、耗样量少,且不需要内标和外标,为蛋白质绝对定量分析提供了一种新的方法。

随机引物PCR鉴定分枝杆菌的方法学研究

目的为了建立RAPD-PCR鉴定分枝杆菌的方法,同时了解其影响因素。方法采用不同引物及其浓度、不同DNA提取方法及其他反应条件进行随机引物PCR。结果分枝杆菌DNA提取后,-20℃30天内结果无影响。扩增的退火温度较低,对反应条件高度依赖。在研究中发现,实验条件的变化,可产生缺带现象,此时需要重复2次,如果3次扩增的指纹图谱相同,则可以确定。结论RAPD-PCR扩增条件的优化组合是获得稳定、可靠的分枝杆菌DNA指纹的关键。

体积排阻色谱在蛋白质药物聚集体领域的应用

蛋白质聚集现象是生物制药行业面临的重大问题之一,对蛋白质药物有效性、安全性、质量可控性有很大影响。体积排阻色谱技术是蛋白质药物及其聚集体检测分析的标准技术,具有操作简单、分离条件温和、基本不破坏蛋白质药物结构等优点。但由于蛋白质与固定相存在非特异性相互作用,采用该法检测时存在洗脱延迟、色谱峰拖尾、基线漂移、蛋白质回收率低等问题。该文介绍了体积排阻色谱的分离原理及实际应用,并对该技术在蛋白质药物检测中存在的非特异性吸附问题及相关方法优化做了简要概述。同时列举了几种与体积排阻色谱互补的可用于蛋白质药物聚集体分析的技术。最后,对体积排阻色谱技术的发展前景进行了展望。

IgG1型单克隆抗体对照品的一级结构解析

对单克隆抗体药物对照品(IgG1型)进行了全面的结构表征。采用ExactiveplusEMR质谱测定了去N糖前后抗体的精确分子量,并通过计算N糖含量得出其完整分子量为148285.0~149020.8,完整去糖后分子量为145810.4,N糖含量为1.67%~2.15%。优化了全柱成像实时等电聚焦毛细管电泳(WCID-cIEF)检测方法,结果显示该抗体等电点分布在8.21~8.74之间,其中主成分等电点为8.61,相对含量为61.43%。继而使用离子交换色谱检测了电荷异质性,发现碱性峰含量为4.1%,酸性峰含量为23.9%,主峰含量为72.0%,与WCID-cIEF结果吻合,并证明了方法间良好的重现性。通过切糖前后的肽图分析,获得糖肽分布信息,识别出糖修饰位点及重轻链的互补决定区(CDR),甲硫氨酸(M)的氧化位点及氧化率,并通过抗体还原前后的肽图解析出二硫键连接。研究结果同时提示该抗体对照品无C末端糖化修饰现象。

一种提取小鼠表皮总RNA的新方法

目的:建立一种从小鼠表皮组织提取高质量RNA的方法。方法:用热击法分离小鼠表皮,用TRIzol法提取RNA,用紫外分光光度计测定RNA的产率和纯度,用琼脂糖电泳和RT-PCR检测RNA的质量和完整性。结果:采用新方法提取的小鼠表皮总RNA,其D260nm/D280nm值为1.8～2.0,大于1.5,且RNA产率高于100μg/g;琼脂糖电泳出现5S、18S和28S等3条清晰的rRNA条带,而且28SrRNA条带的亮度约为18S的2倍;用新方法制备的总RNA可成功地用于RT-PCR实验。结论:采用热击法分离表皮并结合TRIzol法可提取到高质量、完整性好的小鼠表皮总RNA,并能用于相关的分子生物学实验。

基于单颗粒计数的蛋白质定量方法研究进展

蛋白质是执行功能的重要的生物大分子,蛋白质类生物标志物的鉴别与定量和复杂基质中目标蛋白准确含量的测定对疾病的预防、诊断及治疗有重要意义。伴随着生命科学的不断发展,科学家开发出许多种蛋白质定量方法,较为常见的有紫外可见分光光度法、酶联免疫吸附法及基于质谱的定量方法。但是对于高分子量蛋白质,尤其是分子量在200 kDa以上的蛋白质,由于其结构复杂及分子量巨大,导致前处理复杂或反应不专一、不完全,造成定量结果不准确。单颗粒计数法是通过对溶液中粒子逐一计数实现定量,相比于传统定量方法,单颗粒计数法具有灵敏度高、区分度好、外界因素干扰少的特点,加之此类方法样品处理简单,属于非破坏性的分析,适合对高分子量蛋白质进行完整结构水平的定量。总结了蛋白质定量方法,重点关注基于单颗粒计数的3种典型技术,包括单颗粒电感耦合等离子体质谱法(SP-ICP-MS)、单分子阵列技术(Simoa)和电喷雾-差分电迁移率-凝结核颗粒计数法(ES-DMA-CPC),系统阐述了这几种方法的工作原理及在蛋白质定量中的应用,并对未来该领域的发展进行了展望。

单克隆抗体药物表征、计量技术研究及标物研制

单抗是目前最成功的一类生物制品，最近20年发展迅猛，目前已有超过300种单抗处于临床试验阶段，批准上市的单抗数量超过60种，到2020年销售额有望超过1250亿美元。治疗性单克隆抗体制品被广泛批准应用于肿瘤、自身免疫、器官移植和感染性疾病等多个适应症的治疗中，疗效显著、利润丰厚，所以越来越多的企业投入到单抗的开发和生产中来。

计量对我国蛋白质及肽类药物研发生产的重要意义

随着我国医疗卫生事业的快速发展,精准医疗的模式越来越受到重视。蛋白质及肽类药物是实现精准医疗的重要手段,对于保障大众医疗健康具有重要意义。蛋白质与肽类药物发展迅速,但结构复杂,分析与质控技术标准化有较大需求,因此化学计量对于蛋白及肽类药物的研发生产具有重要意义。

电喷雾差分电迁移率分析技术在生物研究中的应用

电喷雾—差分电迁移率分析(ES-DMA)可以快速获取1～500 nm范围的蛋白质或其他生物纳米粒子的粒径分布信息。它与电喷雾质谱技术的不同之处在于,质谱是根据质荷比区分,而ES-DMA分离主要基于粒子的大小和形状,不同大小、不同形状的粒子置于电场中时,将会以不同的速度发生迁移,通过测量气溶胶颗粒迁移的平均速率,最后即可转化得到粒子的粒径。ES-DM A技术作为新型的表征和定量技术手段,推动了生物纳米颗粒的定性和定量研究。总结了ES-DMA的基本原理及其在生物学研究领域中的应用,并对ES-DMA的发展趋势和应用前景作出了展望。

Rad9错配修复功能缺陷与结直肠癌发生的关系

目的探讨Rad9错配修复功能与结直肠癌发生的关系。方法收集100例结直肠癌患者肿瘤样本，采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测hRad9基因突变，采用快速点突变方法构建hRad9L101M点突变质粒并转染Rad9基因敲除的小鼠细胞。采用Westernblot方法检测Rad9表达．采用错配修复报告质粒及流式细胞仪检测活细胞错配修复能力。结果100例结直肠癌患者中，有7例发现了hRad9基因101位氨基酸由亮氨酸突变为甲硫氨酸。mRad9-＋L101M细胞（表达hRad9．L101M突变体的Rad9基因敲除小鼠细胞）和mRad9＋hRad9细胞（表达hRad9的Rad9基因敲除小鼠细胞）的错配修复效率分别为（34．0±5．6）％和（48．0±7．5）％，差异有统计学意义（P〈0．05）。用N-甲基亚硝脲（MNU）处理细胞后，mRad9-＋L101M细胞和mRad9-＋hRad9细胞的存活率分别为（33．7±5．9）％和（21.3±4．7）％，差异有统计学意义（P〈0．05）。hRad9基因101位氨基酸突变导致细胞错配修复效率下降及对MNU的抗性增加。hRad9基因多处翻译后修饰位点突变导致细胞错配修复能力下降。结论hRad9错配修复功能缺陷可能与结直肠癌发生有关。

小鼠Rad1基因剔除引发皮肤肿瘤易感性

生物时刻都面对着细胞内源自由基和环境污染物及辐射等 DNA 损伤因素。DNA 复制过程中也会产生 DNA 损伤。生物经过长期进化。