鸡IL-18cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

运用RT PCR方法,从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系 MDCC MSB1 总 RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin 18,ChIL 18)成熟蛋白基因的 cDNA,并将其克隆到 pMD18 T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到的ChIL 18 cDNA与国外报道的完全一致,包括终止密码子在内其编码区的长度为510bp,编码169个氨基酸残基的蛋白质。将ChIL 18 成熟肽段编码区定向克隆到原核表达载体 pGEX 6P 1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,构建成原核表达质粒 pGEX ChIL18。该质粒的 BL21(DE3)LysS转化菌在 IPTG的诱导下可高效表达GST ChIL18基因融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的32%。

鸡白细胞介素18成熟蛋白全长基因的克隆与序列测定

根据已发表的鸡白细胞介素 18(IL- 18)成熟蛋白的 c DNA序列 ,设计 1对特异性引物 ,应用 RT- PCR从脂多糖(L PS)刺激 10 h活化的 MDCC- MSB1细胞中克隆到编码鸡 IL - 18成熟活性蛋白的完整基因片段 ,其大小为 5 10 bp。经序列测定证实 ,所获得的 c DNA基因序列与文献报道的结果完全一致 ,从而为进一步研究鸡 IL- 18的基因表达、生物学活性以及应用奠定了基础。

减蛋综合征病毒基因组Hind Ⅲ酶切片段的克隆及酶谱分析

以ｐＵＣ１９质粒为载体，采用鸟枪法克隆减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）基因组的ＨｉｎｄⅢ酶切片段，用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ标记的ＥＤＳＶＨｉｎｄⅢ片段探针打点杂交，证实１３个克隆插入了ＥＤＳＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢ片段。酶切分析结果表明，克隆到了Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ７个不同大小的片段，选取含有上述插入片段的、具有代表性的７个相应质粒ｐＵＨＡ、ｐＵＨＢ、ｐＵＨＦ、ｐＵＨＧ、ｐＵＨＨ、ｐＵＨＩ、ｐＵＨＪ，在分别以ＢａｍＨＩ、ＢｇｌⅡ、ＣｌａⅠ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ＸｂａⅠ、ＸｈｏⅠ单酶切的基础上，经适当组合的双酶切，得出各片段存在的单一酶切位点为Ａ：ＢｇｌⅡ、ＥｃｏＲＶ、ＳｍａⅠ、ＸｈｏⅠ位点；Ｂ：ＢｇｌⅡ、ＳｍａⅠ位点；Ｆ：ＢｇｌⅡ、ＥｃｏＲＶ位点；Ｇ：ＰｓｔⅠ位点；Ｈ：０；Ｉ：ＰｓｔⅠ位点；Ｊ：ＥｃｏＲＶ、ＸｈｏⅠ位点。为进一步筛选病毒复制非必需区，构建腺病毒表达载体，以及研究禽类腺病毒的分子生物学特性打下了基础。

鸡白细胞介素18成熟蛋白基因真核表达质粒的构建及其在鸡胚成纤维细胞中的表达

通过PCR方法自含鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)成熟蛋白(mature ChIL-18,mChIL-18)基因的克隆质粒中扩增mChIL-18基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中。阳性克隆鉴定后,在脂质体作用下转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了mChIL-18在CEF中的表达。

煤矿应急救援技术研究若干新进展

在国家科技部社会公益重点研究专项资金资助下,自2001年以来,煤炭科学研究总院及所属分院、研究所在煤矿事故抢险救援技术与装备方面进行了研究,并取得了一些新进展。本文对这些进展作一些简单介绍。

我国煤炭科技发展现状及展望

对我国煤炭科技发展现状及存在问题进行了分析 ,并结合我国煤炭发展的新形势 ,探讨了煤炭科技发展趋势。

鸡减蛋综合征病毒分离株AA－2基因组Hind Ⅲ酶切部分片段的分子克隆

以非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ），经差速离心法纯化，电镜下观察到病毒无囊膜，大小为７０～８５ｎｍ。以蛋白酶Ｋ法抽提病毒基因组，琼脂糖凝胶电泳只出现１条分子量约３４ｋｂ、背景清晰的核酸带。ＨｉｎｄⅢ酶切ＥＤＳＶＤＮＡ可见１０条片段，以ｐＵＣ１９质粒为载体，采用鸟枪法对病毒基因组的ＨｉｎｄⅢ酶切片段进行分子克隆，获得１７个重组质粒，通过酶切、斑点杂交鉴定，证实已经成功地克隆到ＥＤＳＶ的５．２４ｋｂ、２．０２ｋｂ、１．６５ｋｂ、１．４７ｋｂ、１．４１ｋｂ等５个ＤＮＡ片段。

行业共性技术研究中的问题及对策分析

研究、分析了煤炭行业共性技术研究过程中存在的问题 ,探讨加强行业共性技术研究推广的思路 ,及解决行业共性技术中存在问题的方法。

肉仔鸡传染性脑脊髓炎的诊疗

发病情况某专业户从某种鸡场一次性购进商品代肉仔鸡1800只,4日龄开始陆续发病,21日龄后逐渐停止发病,截止35日龄,发病率和死亡率分别为76%和41%左右。水平调查得知,其他养鸡户同一批肉仔鸡均出现同样症状;垂直调查得知,该种鸡已发病,产蛋率下降40%左右。发病后曾用维生素B1、维生素B2、维生素E、鱼肝油、亚硝酸钠及抗生素等药物治疗,

模板钻架的研究及应用

从立井施工工艺的角度，提出了模板钻架的工作原理和结构，同时，给出了模板钻架的工业性试验结果。

三用液压金属模板

三用液压金属模板煤炭科学研究总院北京建井所胡敬东，杨春满（北京）目前，国内采用冻结法施工的井筒中一般在砌筑冻结段外壁和下部基岩段井壁时需分别使用两套不同直径的整体下移金属模板，施工冻结段内壁时又需再用一套液压滑模上行套壁，或在冻结段使用两套小块金属模...

猪伪狂犬病病毒鲁A株的分离鉴定

从山东省某些猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑及内脏中分离到多株病毒 ,对其中一代表毒株进行了全面鉴定。该分离毒株在兔肾原代细胞 ( RK)上和鸡胚成纤维细胞 ( CEF)上连传 5代 ,均出现典型细胞病变 ,再接种于 RK- 13细胞、BHK- 2 1细胞、Vero细胞、PK15细胞和 14 3TK- 细胞 ,均出现典型细胞病变 ;在 RK- 13细胞上的 TCID50 为10 - 6 .52 / 0 .1m L ;在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子 ;对氯仿、乙醚敏感 ,5 6℃ 30 m in灭活 ;能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和 ;病毒接种于家兔和小鼠 ,均出现典型伪狂犬病症状与病变 ;提取所分离病毒的 DNA作为模板 ,应用特异性引物 ,以 PCR方法可扩增出伪狂犬病病毒 g D基因中 2 72～ 5 34nt之间 2 6 2 bp长的特异性片段。上述结果证明 ,所分离病毒为猪伪狂犬病病毒 ,并将其命名为猪伪狂犬病病毒鲁

重组鸡白细胞介素18(rChIL-18)对MDV感染SPF鸡细胞免疫的影响

用马立克氏病病毒(MDV)感染5日龄SPF鸡后,取21日龄和35日龄鸡的淋巴细胞,运用3H-TdR掺入法检测T淋巴细胞对ConA和重组鸡白细胞介素18(rChIL-18)的反应,并用MTT法检测NK细胞和CTL对MD肿瘤细胞系CU147的杀伤活性及rChIL-18和IFN-γ对它们的作用。结果显示,SPF鸡感染MDV后淋转水平显著下降,NK细胞、CTL杀伤活性在感染后21日龄时升高,而在35日龄时NK细胞杀伤活性显著下降。rChIL-18对对照组和感染组SPF鸡的淋转水平和杀伤活性均有提高作用,同样IFN-γ也具有提高NK细胞和CTL杀伤活性的作用。

利用半套式PCR扩增16S rRNA基因检测牛和猪附红细胞体

根据GenBank收录的猪和牛附红细胞体16SrRNA基因序列设计1对通用引物,在其上游引物内侧又设计1条分别针对猪和牛附红细胞体的特异性引物。以这4条引物对出现附红细胞体病典型症状及疑似症状的猪和牛的血样DNA进行半套式-PCR扩增。结果显示,该反应阳性率为58.3%,低于临床解剖和镜检结果。对该基因的序列测定结果进行分析,表明不同动物附红细胞体的16SrRNA基因同源性在80%以上。从该基因来看,附红细胞体与立克次氏体没有同源性,而与肺炎支原体和穿透支原体亲缘关系较近。

三种PCR方法诊断猪伪狂犬病的比较研究

针对伪狂犬病毒gD基因的不同片段设计三对引物 ,分别进行PCR扩增用于猪伪狂犬病的诊断 ,扩增的三个片段的长度分别为 2 62bp、2 1 7pb以及 1 2 0 3bp的全基因。通过比较发现 ,这三种PCR诊断方法均具有很高的特异性和敏感性 ,但扩增gD基因内部 2 62bp的PCR诊断方法种具有突出优点 ,其退火与延伸合成一步 ,其操作可于 1h内完成 ,敏感性更高 ,更适于猪伪狂犬病的快速诊断。

牛IL-18成熟蛋白基因在昆虫细胞中的表达及其活性

目的:在杆状病毒表达载体中表达牛白细胞介素-18(bovine interleukine-18,BoIL-18)成熟蛋白基因,并鉴定其生物学活性。方法:设计一对特异性引物,将编码BoIL-18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac HTb上,构建重组质粒repFastBac HTb-18,转化至DH10Bac感受态细胞中得到重组Bacmid(Bacmid-BoIL18)。在Cellfectin作用下,将Bacmid-BoIL18转染昆虫细胞sf9获得重组杆状病毒,然后将重组杆状病毒感染sf9,感染后不同时间收获sf9细胞,进行SDS-PAGE电泳,分析表达情况;用BoIL-18的原核表达产物作为抗原制备的兔多克隆抗体进行Western blot分析;将纯化的表达产物对牛外周血单个核细胞(PBMC)进行细胞增殖试验,对健康牛脾进行IFN-γ诱生试验,初步分析表达产物的生物学活性。结果:BoIL-18成熟蛋白基因在昆虫细胞中获得了表达,经薄层凝胶扫描分析证实,表达量占总蛋白的21.3%;Western blot分析证明,在相对分子质量(Mr)约为26 000处有一条特异性条带。生物学活性分析表明,纯化的表达产物可明显增强淋巴细胞增殖,促进IFN-γ的产生。结论:BoIL-18成熟蛋白基因在昆虫细胞中获得了表达,表达产物具有良好的生物学活性。

羊伪结核病研究进展

羊伪结核病是由伪结核棒状杆菌引起的一种人畜共患慢性传染病。其特征是在淋巴结或肺脏等组织脏器形成干酪样脓肿 ,国外多称之为干酪样淋巴结炎 (CLA)。该病主要引起患羊消瘦、生产性能低下和死胎 ,严重者发生死亡。人、各种家畜和许多野生动物均可患本病。世界上几乎所有养羊的国家或地区都有本病存在。由于本病发展缓慢、而且致死性低 ,所以常常被人们所忽视。本病是国际上公认的难以防治的传染病之一 ,一旦侵入羊群则很难彻底清除 ,给养羊业的发展造成较大危害。多年来 ,作者对该病的流行病学、病原菌分离鉴定、血清学检测、中西医结合疗法及免疫方法等进行了一些探索和研究 。

牛白细胞介素18成熟蛋白cDNA基因的克隆和表达

应用RT-PCR技术分别从脂多糖(LPS)活化的牛脾脏细胞和肺泡巨噬细胞中克隆到编码牛白细胞介素(bIL-)18成熟蛋白的cDNA基因,其大小为480 bp。将bIL-18克隆到pET32a(+)质粒中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,得到了分子量为38ku的融合蛋白,该蛋白经纯化并复性后,具有诱导MDBK分泌IFN-γ的活性,并且可以刺激ConA活化的外周血单核细胞(PBMC)增殖。使用半定量RT-PCR对其mRNA的体内表达进行了测定,发现不论是否加入刺激剂,牛巨噬细胞都可以持续的表达IL-18 mRNA,但是被LPS活化的PBMC只有微弱表达,肝和脾细胞经LPS活化后也可以检测到IL-18 mRNA的表达,其水平明显高于PBMC,在不同细胞中表达的差异可能反映了其产生成熟IL-18的能力。