H1N1猪流感广东株血凝素基因的克隆与序列分析

用RT- PCR方法扩增H1N1亚型猪流感病毒广东分离株 A/Swine/GuangDong/711/2001 HA基因,对其进行了克隆和测序。结果显示,HA基因全长 1 771 bp,共编码 579 个氨基酸。A/Swine/GuangDong/711/2001HA基因编码的氨基酸序列中有 8 个糖基化位点,5 个位于 HA1 基因的第 27、28、40、104 和 287 位点,3 个位于HA2基因的21、153和213位点。与H1N1亚型猪流感经典毒株比较后发现,血凝素糖基化位点并不是高度保守的。将A/Swine/GuangDong/711/2001与自GenBank读取的1918年人流感毒株 A/South Carolina/1/18、1991 年人流感毒株A/MD/12/91和1997年猪流感毒株 A/Swine/Wisconsin/238/97 等进行核苷酸同源性比较分析,A/Swine/GuangDong/711/2001与A/South Carolina/1/18、A/MD/12/91和 A/Swine/Wisconsin/238/97 等毒株的核苷酸同源性分别为 93. 9%、94. 7%和 93. 9%。从系统发生树来看, A/Swine/GuangDong/711/2001 与 A/SouthCarolina/1/18和A/Swine/Wisconsin/238/97的亲缘关系相近。

表达H1N1、H3N2猪流感病毒HA基因重组质粒在小鼠的免疫效力

应用已构建的真核表达质粒pCI-H1-HA、pCAGGS-H1-HA、pCI-H3-HA和pCAGGS-H3-HA作为DNA疫苗,利用BALB/c小鼠进行免疫保护试验,通过测定不同免疫期HI抗体滴度、分析攻毒后BALB/c小鼠体重变化及肺脏病毒含量,评价DNA疫苗的免疫效力。结果表明:构建的DNA疫苗均可诱导小鼠产生免疫力;BALB/c小鼠体重变化统计学分析显示,免疫组与对照组差异极显著(P<0.01),pCAGGS表达载体构建的DNA疫苗免疫效果优于pCI表达载体构建的DNA疫苗(P<0.05)。

空肠弯杆菌的分离与鉴定的研究

本文报道了从奶牛、产蛋鸡、屠宰场的猪、舍饲的绵羊和山羊的粪便及肠内容物分离空肠弯杆菌的试验结果。从肠内容物取样,猪分离率为32.61％;粪便材料,猪、鸡、奶牛、山羊和绵羊分别为26.47％,13.04％,9.76％,13.33％和6.82％。利用改良的布氏半固体培养基,接种新分离株后置37℃保存,解决了弯杆菌新分离株保存难题。5株新分离株分别于10、20、30和40天检查,全部存活,效果可靠。这一方法对分离鉴定弯杆菌时菌株的短期保存,具有实际的应用价值。

抗独特型抗体对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的免疫作用

用PRRSV感染SPF猪,血清检测结果显示,机体不仅产生抗PRRSV抗原的各种抗体(Ab1),而且产生针对这些抗体的抗独特型抗体(Ab2).根据各种蛋白质的等电点不同,应用IEF技术分离纯化出PRRSV感染猪血清中的不同IgG.分别以纯化的抗PRRSV-GP5蛋白、抗PRRSV-M蛋白的Ab2免疫SPF猪各5头,7 d后经鼻腔感染PRRSV,定期采集血样进行病毒分离或鉴定试验.抗PRRSV-GP5蛋白的Ab2免疫的猪,其血样自感染后3～7 d均检出PRRSV;3头猪在感染后14～63 d未检出PRRSV 2头猪在感染后14～35 d检出PRRSV,从42～56d转为阴性,其中1头猪在63 d时检出PRRSV.抗PRRSV-M蛋白的Ab2免疫的猪,其血样自感染后3～7 d均检出PRRSV;2头猪在感染后14～63 d未检出PRRSV 3头猪在感染后14～35 d检出PRRSV,从42～56 d转为阴性,其中1头猪在63 d时检出PRRSV.抗PRRSV-GP5和抗PRRSV-M蛋白的Ab2免疫作用显著,可作为PRRSV-GP5和PRRSV-M蛋白的替代抗原产生具有中和效应的抗体,保护机体免受PRRSV的感染.

改良菌落原位杂交技术快速筛选NDVF基因阳性克隆株

应用从表达型质粒载体构建的ＮＤＶＦ基因文库中筛选阳性克隆株的改良融合蛋白质抗体蛋白质原位杂交技术，可使菌落在硝酸纤维素薄膜上增殖，经适当处理后，即可用特异性抗体探针进行原位筛选，获得含目的基因编码的特异抗原蛋白的阳性克隆株。

SINS静基座初始对准的超球体采样STFUKF算法

初始对准是实现惯性导航高精度的一项关键技术。无迹滤波(UKF)在SINS系统静基座大方位失准角初始对准中计算量大,在不精确或错误的噪声统计情况下,收敛速度变慢,估计精度下降,甚至滤波发散。针对这一问题,将超球体采样与强跟踪无迹滤波(STFUKF)算法相结合,提高了运算速度和对准精度。利用SINS的非线性误差模型,通过数字仿真将卡尔曼滤波、UKF和STFUKF的性能进行比较,证明该方法具有精度高、抗干扰性好、跟踪能力强的特点。

应用肠道微环境重组技术提高家禽抗病力的研究──雏鸡口服乳杆菌XF－9301制剂的安全性和效力试验

应用自制的ＸＦ－９３０１乳杆菌制剂给清净雏鸡群和染疫雏鸡群口服，进行安全试验和效力试验，证实ＸＦ－９３０１制剂是一种安全、有效的微生态制剂。染疫雏鸡群口服ＸＦ－９３０１组与未经处置组１月龄雏鸡存活率及雏鸡白痢等腹泻性疾病发病率间存在着显著差异（Ｐ＜０．０５）。

弯杆菌富集培养试验

本文报道了一种固－液双相培养系统富集培养弯杆菌的方法。这种双相培养系统系由在扁瓶底层制备的胰胨大豆胨琼脂平板与平板上层覆加的改良布氏肉汤所构成。在常规培养条件下，双相培养系统与单纯改良布氏肉汤进行培养对比试验。结果表明，两种培养方法之间存在着显著差异（ｐ＜０．０５），双相培养系统明显地优于单纯改良布氏肉汤。

亚硝基胍诱变巴氏杆菌基因突变株的生长表现及其毒性试验

亚硝基胍诱变巴氏杆菌基因突变株的生长表现及其毒性试验１）胡永浩汪清曾巧英于风刚沈正达（甘肃农业大学动物医学系兰州７３００７０）微生物分子遗传学研究表明，病原菌通过诱变使ＤＮＡ分子结构中的某一位点发生改变而形成基因突变菌株。基因突变的类型多种多样，营养...

一种改良的提取猫细小病毒基因重组质粒（pEH20）DNA方法

通过对碱变性和ＰＥＧ法提取纯化质粒ＤＮＡ的改进，成功地进行了ｐＥＨ２０ＤＮＡ的制备，得到了高纯度的质粒ＤＮＡ。改进的方法使碱变性法与ＰＥＧ法有机地衔接起来，具有经济、省时、简便、可靠的特点，可用于相关质粒ＤＮＡ的大量制备。

苦马豆素抗牛病毒性腹泻病毒的研究

【目的】疯草是中国西部影响草地生态和畜牧业健康发展的毒草之一。主要有豆科棘豆属和黄芪属有毒植物等,在冬季牧草严重缺乏的时节,牛羊等牲畜被迫采食后可引起中毒和生产性能下降,甚至死亡,每年给我国草地生态和畜牧业造成的直接经济损失达几十亿元,是危害最严重的毒草。目前,我国西部天然草地动物因疯草中毒死亡所造成的经济损失仍持续剧增。苦马豆素被认为是引起动物疯草中毒的主要毒性成分。由于疯草分布广泛,资源丰富,如何改善草地生态,合理开发利用疯草成为研究的课题和方向。近几十年来,随着对疯草研究的深入和扩展,人们发现苦马豆素不仅具有良好的抗肿瘤效果,还可作为免疫调节剂、抗HIV及扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等药物使用。目前,国内在对苦马豆素抗肿瘤、调节机体免疫方面研究较热,但是,对苦马豆素在抗病毒活性、作用机理方面的研究尚无相关报道。为了探讨茎直黄芪中生物碱苦马豆素(swainsonine,SW)抗牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的作用机制,明确其体外抗病毒作用效果,为抗BVDV的药物筛选提供参考依据。【方法】利用细胞培养技术,采用CPE观察法和MTT比色法相结合的方法测定不同浓度SW对牛肾原代细胞(madin-darby bovine kidney cells,MDBK)的毒性作用,确定药物的安全浓度和TD50,并分别采用先加药后感染病毒、先感染病毒后加药、药毒作用2 h后加入、感染病毒同时给药后再加药四种作用方式,检测不同浓度SW对BVDV入侵的阻断作用、复制的抑制作用、直接杀伤作用和综合作用,并计算不同作用方式下的治疗指数。【结果】结果显示:SW浓度小于0.256μg·mL-1范围内对MBDK细胞无毒性作用,在大于0.512μg·mL-1浓度下MBDK细胞表现出一定程度的病变,TD50为2.512μg·mL-1,按Reed-Muench氏法计算BVDV TCID50为10-4.7/0.1mL;在体外随苦马豆素质量浓度的增加,其抗BVDV作用具有很好的量效关系,且与作用方式有关,比较四种作用方式下的治疗指数1.05、2.47、2.08和3.21,说明SW对BVDV的综合作用(65.29%,P<0.01)和复制(65.05%,P<0.01)的抑制作用较好,亦有一定的直接杀伤作用,但对其入侵的阻断作用不佳。【结论】SW在体外有良好抗BVDV活性作用,并推测苦马豆素(SW)抗病毒的主要效应可能是SW能进入细胞内抑制BVDV的复制增殖以及直接灭活游离BVDV而发挥作用。

禽源多杀性巴氏杆菌保菌方法研究

通过对禽源多杀性巴氏杆菌Ｐ１０５９株和Ｃ４８－１株及６株田间分离细菌的保存观察试验，表明用脱纤羊血和感染小鼠肝脾组织在－２０℃条件下，禽源多杀性巴氏杆菌可存活２年；用鲜血斜面封盖石蜡油保存法，禽源多杀性巴氏杆菌在４℃条件下可存活３个月，菌株保存前后生物学特性及毒力不发生变化。试验提供的方法对禽霍乱流行病学调查和血清分型研究具有实际意义。

黄芪多糖联合顺铂对小鼠Lewis肺癌细胞肺转移的影响

目的观察黄芪多糖(APS)联合顺铂(DDP)对小鼠Lewis肺癌细胞肺转移、核因子(NF)-κB、P38、P53及Caspase-9表达的影响。方法将90只Lewis小鼠随机分为模型组、顺铂组(6mg/kg DDP)、APS组(50、100、200)mg/kg,联合用药组[1/2 DDP+APS,即:(3+25、3+50、3+100)mg/kg]。各组均于造模第2天起用药,APS每日1次,DDP每周1次,连续20d。观察肿瘤肺转移情况,采用Real-time PCR法和Western blotting法检测肿瘤组织中NF-κB、P38、P65蛋白和基因,并用免疫组织化学检测Caspase-9的表达。结果与模型组相比,各治疗组均可降低肺转移灶数目(P<0.05或P<0.01);除P38外,APS中、高剂量组可使小鼠Lewis肺癌组织中NF-κB p65、P53表达降低,Caspase-9表达增高;联合用药高剂量组作用则接近DDP组。结论 APS可抑制小鼠Lewis肺癌细胞的转移,抑制NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活,这可能是其抑制肿瘤转移的机制之一;APS与减半剂量的DDP铂类化疗药物联合使用时,作用增强,APS对DDP有增效减毒作用。

奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及耐药性分析

为弄清中国不同地区奶牛乳房炎主要病原菌种类、分布情况及其药物敏感特性,并为奶牛乳房炎的综合防治提供依据,对在内蒙古、甘肃、四川和上海4地部分奶牛场采集的472份临床型或亚临床型乳房炎乳样进行细菌分离鉴定,并对主要病原菌进行药敏试验。结果表明,检测奶样中检出细菌482株,其中金黄色葡萄球菌149株,占30.91%;表皮葡萄球菌91株,占18.88%;无乳链球菌60株,占12.45%;停乳链球菌60株,占12.45%;乳房链球菌35株,占7.26%;大肠杆菌33株,占6.85%。各个地区优势菌群存在差异,药敏试验结果也不相同,分离出的细菌绝大部分对环丙沙星、左氟沙星、氧氟沙星和先锋霉素V高度敏感,但对青霉素、红霉素和万古霉素有较强耐药性。

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆及3AB基因的原核表达

从感染口蹄疫病毒 (foot- and- m outh disease virus,FMDV)的细胞中提取总 RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT- PCR)获得了长度约为 14 0 0 bp的核酸片段 ,与预期长度相符。扩增产物经克隆后 ,测序证明其含有完整的 3ABC基因。该序列与国外参考序列 0 1K/ 6 6相比 ,同源性在 99%以上。亚克隆 3ABC基因至表达载体 p Tri Ex- 4 Neo中 ,通过序列分析发现 ,克隆到 p Tri Ex- 4 Neo载体上的片段于 3ABC基因 70 9～ 72 5 bp之间有 17bp的缺失 ,碰巧在 3AB基因后形成一终止密码子 ,但 3AB基因的阅读框架完整。选出含有 3AB基因完整阅读框架的阳性克隆 ,用 IPTG诱导表达 ,收集菌液进行 SDS- PAGE电泳、Western blotting分析 ,结果表明 ,3AB基因在大肠杆菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 33.5 ku的融合蛋白 ,并能被口蹄疫病毒阳性血清识别。经薄层扫描分析 ,表达的目的蛋白占总蛋白量的 2 6 %以上。该项研究为应用重组

山羊痘的流行及防治措施

山羊痘是由山羊痘病毒属的痘病毒引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病。文章从山羊痘流行病学、症状、诊断和防治措施等方面对山羊痘进行综述。

黄芪多糖对Lewis肺癌小鼠细胞因子及顺铂所致免疫功能低下的影响

目的观察黄芪多糖(APS)对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、细胞因子及顺铂(DDP)所致免疫功能低下的影响。方法 90只小鼠,设空白对照组10只,余80只依次造模为荷瘤小鼠,并随机分为8组:模型组(等体积生理盐水),顺铂阳性对照组(6 mg/kg DDP),APS低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高剂量(200 mg/kg)组,联合用药低、中、高剂量组(DDP剂量减半,APS各剂量同上),于造模次日起各组分别腹腔注射等体积的药物0.3 mL。DDP每周一次,其余药物每天1次,连续20d。于第21天取血清采用ELISA法测定细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平,并观察各组抑瘤率及免疫器官指数。结果 DDP、APS低、中、高剂量及联合用药低、中、高剂量组对小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑瘤率分别为49.30%、17.21%、39.68%、42.98%、51.02%、57.21%、65.11%(与模型组比较P<0.05或0.01;联合用药组与DDP组比较P<0.05)。与空白对照组比较,APS中、高剂量组和联合用药组脾脏指数显著升高;与模型组比较,APS高剂量和联合高剂量脾脏指数差异有显著性(P<0.05);与DDP组比较,APS各剂量和联合用药组小鼠胸腺指数和脾脏指数均升高。结论 APS能提高Lewis肺癌小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平;增强DDP所致免疫功能低下小鼠的免疫功能,对免疫器官有一定的保护作用;能抑制小鼠Lewis肺癌细胞的生长,在与DDP减半量联合使用时可使DDP抑瘤作用增强,且其机制可能与增强机体的免疫功能有关,说明APS对DDP有一定的增效减毒作用。此项研究在实体瘤的治疗中有潜在的应用前景。

人源肺细胞cDNA文库构建及与流感病毒NP互作宿主蛋白的筛选

【目的】构建肺组织细胞Calu-3及A549的高质量酵母cDNA文库并筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主因子,为深入研究流感病毒NP蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Calu-3及A549细胞的总RNA,混合后反转录生成cDNA,利用长距离PCR（LD-PCR）扩增合成dscDNA,用CHROMA SPINTM＋TE-400纯化柱纯化dsDNA,按照Clontech公司的Make Your Own＂Mate＆Plate＂Library System操作程序,将带有同源臂的dscDNA与线性化p GADT7-Rec共同转化Y187酵母感受态细胞,涂布SD/-Leu平板后于30℃培养4d左右,收集所有菌落,混匀分装即为Calu-3和A549细胞cDNA的酵母文库,并对文库库容、滴度及多样性进行分析。利用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切将A/Auhui/2/2005（H5N1）NP定向插入pGBKT7载体,构建高致病性流感病毒NP的诱饵质粒p GBKT7-NP,经验证该质粒无自激活活性,并进一步采用构建完成的Calu-3/A549细胞酵母文库进行杂交筛选,筛选得到的正确阅读的猎物质粒与诱饵质粒共转Y2H Gold酵母菌,分别以BD-P53/AD-T7作为阳性对照和BD-Lam/AD-T7作为阴性对照,挑取最终在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/Aro A（SD/-4/X/A）固体培养板上生长良好且变蓝的菌落,即为候选与目标蛋白互作阳性的蛋白,提取酵母质粒,进行测序分析、序列比对和Gene Ontology分析。【结果】提取两种细胞RNA 28S与18S条带清晰,5S条带暗淡,表明所提RNA质量较高,基本无降解;对提取的RNA反转录纯化获得dscDNA,dscDNA条带呈弥散状,片段大小分布于500—2 000bp之间,说明不同丰度及大小的RNA均成功反转录;构建的dscDNA文库库容为1.5×10^7,滴度为2.2×10^8cfu/m L,重组率为88%,PCR鉴定文库插入片段,条带大小不一、多样性好;利用诱饵质粒与文库进行双杂交筛选,回交验证后得到11个与NP蛋白互作的宿主因子。经Gene Ontology分析显示,11个宿主因子参与的生物过程包括：细胞凋亡、胚胎发育、可变剪接、转录调节及细胞增殖等;涉及的分子功能包括：GTP结合活性、金属离子结合活性、DNA结合活性及转录因子活性。【结论】成功构建同时含有Calu-3和A549两种人源肺细胞cDNA的酵母文库,文库覆盖cDNA更全面,为后期筛选与流感病毒其它蛋白互作的宿主蛋白奠定基础,筛选得到与NP蛋白存在相互作用的宿主因子为进一步深入研究NP功能提供了可靠的前期数据。

小反刍兽疫研究进展

小反刍兽疫病毒(PPRV)是副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbolivirus)的成员,主要感染山羊、绵羊等小反刍动物,引起一种高度接触性病毒性传染病。小反刍兽疫为一种重大的外来性疾病,2007年在中国西藏自治区日土县首次发生。自2013年末以来中国新疆、青海、甘肃、宁夏、内蒙、湖南、辽宁等地频繁暴发小反兽疫疫情,给中国的畜牧业带来了巨大的损失,引起极大的重视。为更好的分析小反刍兽疫的病原特性及采取有效的防控措施,文章对小反刍兽疫的病原学及疫苗研究进展进行论述。