裂殖壶菌pks2基因启动子序列扩增及其活性分析

针对目前裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)基因工程相关研究中,对内源启动子的了解和利用仍处在初步阶段的现状,本研究从裂殖壶菌中产多不饱和脂肪酸的主要途径聚酮合酶(PKS)途径出发,利用热不对称交错PCR技术(TAIL-PCR),针对pks2基因扩增出了未知的5’端侧翼序列,初步分析得到pks2基因启动子序列,并分别在原核宿主大肠杆菌(Escherichia coli)与真核宿主酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中对启动子活性做进一步研究,发现了pks2基因启动子可以在大肠杆菌和酿酒酵母中有效启动绿色荧光蛋白的表达,而且pks2基因启动子相较于pks1、pks3基因启动子具有更高的启动活性,显现出了其作为启动子用于基因工程研究的可操作性。

别藻蓝蛋白β亚基基因在莱茵衣藻中重组表达及其对光能传递的影响研究

为了探究别藻蓝蛋白与类囊体膜光合系统之间的光能传递规律,及其与异源类囊体膜光合系统之间光能转移的可能性,本研究构建了含有钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的别藻蓝蛋白β亚基基因(apcB),及合成藻蓝胆素的血红素氧化酶基因(ho)和铁氧还蛋白氧化还原酶基因(pcyA)的转化载体pHyg3-apcB-ho-pcyA,利用玻璃珠转化法将其导入莱茵衣藻中。聚合酶链式反应筛选验证阳性转化藻株,Southern Blot结果表明基因apcB、ho、pcyA成功转化入莱茵衣藻基因组中。而后将转化藻株与对照藻株均置于高光(50μmol·m^(-2)·s^(-1))和低光(25μmol·m^(-2)·s^(-1))条件、白光和绿光条件中培养,并检测别藻蓝蛋白β亚基的表达、总叶绿素含量、77 K低温荧光、光系统表观电子传递效率、生物量变化。结果显示:实时定量PCR分析和Western Blot检测表明外源基因apcB,pcyA和ho均在转基因藻株Cr-ApcBHP中得到了转录表达。高光和低光条件下光系统Ⅱ(PSⅡ)和光系统Ⅰ(PSⅠ)位置处的荧光峰均显著高于对照莱茵衣藻藻株CC-849,绿光中PSⅡ荧光峰(波长为690 nm)显著高于对照藻株;高光与低光和白光与绿光条件下转基因藻株的光系统Ⅱ的表观电子传递速率(ETRPSⅡ)值均高于对照藻株,但生物量并未见明显提高。这些结果表明转基因莱茵衣藻中可能存在自重组别藻蓝蛋白到光系统核心的光能传递,但是吸收的光能没有达到促进生物量积累的作用。本研究为利用重组表达蓝藻藻胆蛋白提高异源类囊体膜的光合作用进行了尝试。

两种不同形态节旋藻培养的光照条件研究

为了有效利用节能高效的LED光源促进节旋藻(Arthrospira platensis)这种具有高营养价值蓝藻的生长和有机物质积累,提升节旋藻产业化水平,本实验研究了光照周期、光照强度、红蓝LED光比例对螺旋形节旋藻品系A.platensis OUC 623和直线形节旋藻品系A.platensis OUC 793藻株生长和有机物积累的影响,并进行正交实验,分别以藻株生物量、色素、多糖、藻蓝蛋白、蛋白质含量为指标,分析得到最适光照条件。实验结果证明红光LED可以显著提高藻株的生长速率,蓝光LED会促进积累有机物,实验中623藻株在红∶蓝=6∶1的LED光下比相同条件的白色LED光生物量提高了90.74%,在蓝∶红=6∶1的LED光下,藻蓝蛋白、蛋白质和多糖的积累量较白色LED光分别提升358.84%、342.11%和168.26%;793藻株在红∶蓝=6∶1的LED光下比相同条件的白色LED光生物量提高了61.74%,在蓝∶红=6∶1的LED光下,藻蓝蛋白、蛋白质和多糖的积累量较白色LED光分别提升了352.79%、955.42%和208.11%。实验中发现在最适光照条件下623藻株的生长、色素(叶绿素a和类胡萝卜素)和多糖的积累明显高于793藻株,793藻株在蛋白质和藻蓝蛋白的积累量上明显高于623藻株,且623藻株更适宜短时间低强度的光照,推测623对光照更敏感,其卷曲螺旋结构是为了相互遮盖避光以适应环境,793藻株更能适应高强度和长时间的光照。本研究探索了2种不同形态的节旋藻藻株623和793的光照培养条件,不同的藻株表现出不同的优势,这为满足节旋藻产业化需求提供了更多选择,为节能高效的LED光源在节旋藻大规模培养和藻蓝蛋白等有机物生产中应用以达到高产、节能的目标提供了实验依据。

钝顶节旋藻别藻蓝蛋白基因克隆、分析及重组表达蛋白荧光活性的研究

为探究蓝藻藻胆体核心色素蛋白-别藻蓝蛋白单个亚基的光学活性和功能,本研究克隆了钝顶节旋藻(Arthrospira platensis FACHB314)中的脱辅基别藻蓝蛋白基因apcAB及其亚基基因apcA和apcB。节旋藻基因组中apcAB全长共1056 bp,由apcA和apcB串联组成,中间间隔84 bp。其中,apcA和apcB基因的全长均为486 bp,且均编码161个氨基酸,预测分子量分别约为17.39和17.33 kDa,它们分别编码的α和β亚基均属于Globin_like超级家族,系统进化树分析显示其氨基酸序列在蓝藻和节旋藻中较为保守。将克隆出的亚基基因apcA、apcB分别同前期A.platensis FACHB314中获得的藻蓝胆素合成相关基因ho和pcyA以及色基裂合酶基因(cpcE、cpcF、cpcU、cpcS、cpcT)共同转化至大肠杆菌中,获得重组别藻蓝蛋白亚基菌株E.coli HPEFUSTA、E.coli HPEFUSTB。SDS-PAGE和Western Blot均显示重组菌株中已成功表达别藻蓝蛋白单亚基。荧光检测结果显示,在600 nm波长激发下,两株重组菌株在640 nm处均出现了别藻蓝蛋白特征荧光发射峰。这些结果表明在重组大肠杆菌中表达的脱辅基别藻蓝蛋白的单亚基可以和藻蓝胆素结合,形成有光学活性的别藻蓝蛋白,这为研究蓝藻中藻胆体的组装和功能提供有效的元件,为别藻蓝蛋白在医药、荧光检测方面的应用奠定了基础。

节旋藻和螺旋藻对7种抗生素敏感性的比较研究

对两种丝状蓝藻(钝顶节旋藻和盐泽螺旋藻)在基因工程中常用作选择试剂的7种抗生素———氯霉素、氨苄青霉素、红霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素的敏感性作比较实验.结果表明,两种蓝藻对抗生素的敏感性既有共同的特点,也有明显的差异.它们对红霉素、氯霉素和链霉素最敏感,致死浓度分别为0 1,0 5和5μg/cm3.两种蓝藻对氨苄青霉素比较敏感,1μg/cm3的氨苄青霉素即可抑制Arthrospira 341和Spirulina 351的生长,但6d后生长恢复.Arthrospira 341和Spirulina 351对卡那霉素、庆大霉素和新霉素均有抗性,而且存在很大差异:300μg/cm3的卡那霉素对Arthrospira 341的生长仍然没有影响,但对于Spiruli na 351,50μg/cm3的卡那霉素即对其生长有明显抑制作用;200μg/cm3的卡那霉素即可将其全部致死.200μg/cm3的庆大霉素和300μg/cm3的新霉素不能抑制Arthrospira 341和Spirulina 351的生长,但在这两种抗生素环境中两种藻的生长状态有很大差异.并验证了氯霉素、红霉素和链霉素是节旋藻和螺旋藻基因转化过程中的有效的抗性选择剂,也从对抗生素敏感性方面表明节旋藻和螺旋藻两个属的遗传差异.

牙鲆生长激素基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法, 从牙鲆(Paralichthys olivaceus)脑垂体总RNA中扩增出编码牙鲆生长素(GH)成熟肽基因序列.重组至融合表达载体pGEX-4T-3中,构建成牙鲆GH基因融合表达载体pGEX-gh, 转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性克隆,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE电泳显示在45kD处有特异的蛋白条带出现,该蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加,3h达最高值,达到细胞总蛋白的18.3%.该融合蛋白在胞内主要以包涵体状态存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后用Western-blotting检测表明其为牙鲆生长激素,并通过酶联免疫吸附受体法证实其具有生物学活性.

莱茵衣藻细胞壁的功能组分及组装机制的研究进展

本文综述了20世纪60年代以来莱茵衣藻细胞壁结构和组装机制的研究进展,从起初所认为的纤维素层直至观察到糖蛋白的晶格结构;从显微水平、组分分析、分子水平3个层面论述了关于莱茵衣藻细胞壁功能组分的研究,这对揭示莱茵衣藻细胞壁形成的机制,及糖蛋白在高等植物和其他藻类细胞壁形成中的作用有指导意义。

江蓠属海藻龙须菜的基础研究与大规模栽培

江蓠属的龙须菜是1种重要的产琼胶海藻。从2000年在广东汕头南澳岛栽培成功以来,迅速在福建、浙江、山东和辽宁沿海得到发展,成为继海带、紫菜和裙带菜之后又一个新兴的海藻栽培产业群。本文综述了龙须菜遗传学研究成果及龙须菜栽培产业建立和发展的关键因素,包括龙须菜南移栽培,981龙须菜良种培育的技术要点。

8种抗生素对塔玛亚历山大藻生长的影响

对一株有毒的塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense (Lebour) Balech)进行了8种抗生素—氯霉素、红霉素、林可霉素、庆大霉素、金霉素、氨苄青霉素、新霉素和链霉素的敏感性实验.结果表明,该藻对抗生素较为敏感.其中的5种:氯霉素、红霉素、林可霉素、庆大霉素和金霉素,对藻8 d比生长速率的EC50分别为2.45μg/cm3,25.2μg/cm3,7.95μg/cm3,285 u/cm3,58.7μg/cm3,可用作该藻基因工程的选择压力,其对应的抗性基因可以作为基因工程阳性选择标记基因,应用于塔玛亚历山大藻的遗传操作研究.新霉素和链霉素对A.tamarense的生长无明显抑制作用,可以用于藻株无菌化培养而应用于甲藻产毒机制和赤潮爆发机理的研究,还应用筛选出的抗生素对藻培养物进行了除菌实验.

无菌钝顶螺旋藻单细胞的制备和再生

用含有 0 .75mol/LNaCl的Zarrouk培养基洗去藻丝体表面的角质鞘 ,可获得大量有活性并能再生的单细胞 ,再生率为 2 8.6%。用 0 .4%的次氯酸钠溶液消毒藻丝体 5分钟 ,恢复培养后再置于含有终浓度均为 1 50 μg/μl的卡那霉素、庆大霉素和新霉素Zarrouk培养基中 35℃ 48h杀菌 ,最后用含 1 .5mol/LNaCl的Zarrouk培养基对藻丝体洗壁处理 1min 。

7种鲽形目鱼类生长激素基因cDNA序列的克隆及系统分析

从7种重要鲽形目经济鱼类——高眼鲽（Cleisthenes herzensteini）、黄盖鲽（Limanda yokohamae）、木叶鲽（Pleuronichthys Cornutus）、宽体舌鳎（Cynoglossus robustus）、石鲽（Platichthys bicoloratus）和条鳎（Zebrias zebra）、夏鲆（Paralichthys dentatus）的脑垂体中提取mRNA，通过RTPCR方法，克隆了含开放阅读框的生长激素（growth hormone，GH）cDNA序列，与本实验室已克隆的大菱鲆和漠斑牙鲆、已报道的鲆鲽鱼类及外群鱼类共22条生长激素基因cDNA进行了序列比对和同源性分析．测序结果显示，高眼鲽、黄盖鲽、木叶鲽、宽体舌鳎、石鲽、条鳎和夏鲆的GHeDNA长度依次为479，564，519，440，564，440，522bp，编码140～170个氨基酸的成熟GH多肽片段．通过序列比对，这7种蛋白序列与其他已知的鲆鲽鱼类GH序列具有较高的同源性，同科的鱼类之间同源性更高．运用PAUP软件对15种鲽形目鱼类与另外7种不同种属鱼类进行了分子系统进化树分析，结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致，大菱鲆和塞内加尔鳎各自单独形成一个分支且与鲆科和鲽科鱼类相距较远，其中寒内加尔鳎等种类的分类地位与根据线粒体DNA序列分析的系统发生模式基本吻合．说明生长激素基因可以有效地用于研究鲽形目等硬骨鱼类的亲缘关系及分类地位．

节旋藻FACHB341 Rubisco基因部分序列的克隆和分析

以节旋藻FACHB341为材料,对所克隆Rubisco基因进行了核苷酸序列测定和分析,由此推导出相应的氨基酸序列,并与部分其他蓝藻的同源基因进行了同源性分析。结果表明:所克隆DNA片段包含Rubisoo大小亚基基因部分序列及rbcX基因序列,长度为2073 bp,其中rbcL和rbcX基因之间存在两个转录茎环结构;大小亚基酸性氨基酸和碱性氨基酸的比例分别为13.14％和14.51％,疏水氨基酸的比例为42.16％;rbcL核苷酸序列与集胞藻PCC6803、Prochlorothrix hollandica、聚球藻PCC6301、Agmenellum quadruplicatum和鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性分别为91.7％、79.9％、74.8％、77.2％和76.1％;rbcS核苷酸序列与鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性为67.6％,而与PCC6301和集胞藻PCC7002同源序列的相似性分别为30.1％和63.8％。

裂殖壶菌诱变筛选的研究

首次采用紫外诱变和喹禾灵筛选的方法,选育出2株二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)含量高的裂殖壶菌(Schizochytrium)突变菌株OUC002和OUC007,其中OUC002生物量(6.82g·d-1·L-1)和DHA含量(15.31%),分别比对照菌株OUC168提高8.08%和13.74%;OUC007生物量(7.04g·d-1·L-1)和DHA含量(17.33%),比对照菌株分别提高11.57%和28.75%。通过GC-MS(气质联用)对OUC007脂肪酸组成进行分析,DHA含量达到脂肪酸的37.28%。本研究为裂殖壶菌的发酵生产提供了性状优良的菌种,并为裂殖壶菌菌种选育提供了新方法。

植物激素对裂殖壶菌生长与DHA含量的影响

研究了6种植物激素(BA、GA、KT、IBA、NAA和IAA)对裂殖壶菌OUC175生长和DHA含量的影响。结果显示,在适宜的浓度条件下,6种植物激素都能不同程度提高裂殖壶菌生长速度和DHA含量,但是浓度过高产生抑制作用。6种植物激素对裂殖壶菌生物量和DHA含量的适宜浓度分别是:BA,3mg/L;KT,10mg/L;GA,1mg/L;IBA,3mg/L;NAA,6mg/L;IAA,3mg/L。BA在添加量3mg/L时,裂殖壶菌的生物量和DHA含量分别比对照组提高27.1%和30.0%。

螺旋藻对六种抗生素的敏感性研究

通过 6种基因工程中常用抗生素对螺旋藻生长抑制的研究发现 ,钝顶螺旋藻S6和极大螺旋藻SM对卡那霉素和新霉素不敏感 ,10～ 70 0 μg/ml的卡那霉素和 10～ 30 0 μg/ml新霉素仍不能抑制其生长 ;S6 和SM对庆大霉素的敏感性存在较大差异 ,液体培养中的抑制浓度分别是 30 0 μg/ml和 50 μg/ml;S6 和SM品系对氨苄青霉素和链霉素较敏感 ,固体培养中 5.0～ 50 .0 μg/ml的氨苄青霉素对它们有致死作用 ;液体培养中链霉素的抑制浓度是 5.0 μg/ml,固体培养中链霉素的致死浓度是 50 μg/ml;S6 和SM对氯霉素最敏感 ,液体培养时 0 .1μg/ml的氯霉素可抑制螺旋藻的生长 ,固体平板致死浓度是 1.0 μg/ml。应用电转化法将带有CAT基因片段的同源重组质粒导入螺旋藻细胞 ,用含有 2 0 μg/ml氯霉素Zarrouk固体平板筛选出了抗性转化子 ,研究结果表明 ,氯霉素是螺旋藻转化系统中理想的抗性选择试剂。

大菱鲆生长激素基因cDNA的克隆、序列分析及分子系统研究

为了从分子水平研究大菱鲆生长激素作用机制及进化机制。以大菱鲆(Scophthalmus maximus)为材料从脑垂体中提取mRNA,利用SMART-RACE技术建立大菱鲆脑垂体cDNA文库,并从该文库中克隆出大菱鲆生长激素(growthHormone,GH)cDNA全长序列。测序结果表明,克隆的大菱鲆GH cDNA序列全长为876 bp,包括108 bp的5’UTR和174 bp的3’UTR序列。该基因的开放阅读框全长591 bp,编码由197氨基酸残基组成的生长激素成熟肽序列,用生物软件DNASTAR计算大菱鲆生长激素蛋白分子量为1 909.22,等电点为6.24。将大菱鲆与漠斑牙鲆、褐牙鲆等共7种鲆鲽鱼类GH成熟肽氨基酸序列进行比较分析,结果显示大菱鲆与其他6种鲆鲽鱼类序列同源性均为70%左右,而鲆科鱼类与鲽科鱼类间生长激素基因同源性很高(≥80%),说明大菱鲆与鲆科、鲽科鱼类的同源性较低。另外,运用PAUP软件对7种鲆蝶科鱼类与另外8种不同种属鱼类进行了分子系统进化树分析,结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致,大菱鲆单独形成1个分支且与鲆科和鲽科鱼类相距较远,此结果为在形态学分类基础上进一步定义菱鲆属鱼类分类提供了理论依据。

大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的研究进展和产业化现状

本文综述了近 10年来国际上在雨生红球藻的生物学特性、细胞内积累天然虾青素的诱导条件方面的研究进展 ,以及应用光生物反应器大规模培养雨生红球藻工业化生产天然虾青素的现状 。

摄食转基因集胞藻牙鲆的安全性评价

评价转牙鲆生长因子基因集胞藻作为鱼类饲料添加剂的安全性。将摄食转基因集胞藻的牙鲆肌肉以10.0 g/kg.BW.d剂量给小鼠连续灌喂8周,对试验鼠的摄食量、体重、血液常规和血生化指标、脏体系数以及生殖机能进行了检测,对组织器官进行了病理学检查。研究结果显示,灌喂摄食转基因藻牙鲆的小鼠,其摄食量、体重、血液常规、血生化指标及脏体系数与对照小鼠无显著差异(P>0.05),其生殖机能和肝、肾等组织器官未受损害。表明转基因集胞藻作为牙鲆饲料添加剂不能通过食物链对食鱼生物造成不良影响,是安全无毒的。

人/鲑降钙素嵌合基因在大肠杆菌中的串联表达

人工合成人/鲑降钙素嵌合基因,用同尾酶法构建多拷贝串联基因表达质粒pLEX-nCT(n=1,2,3,4,5)(单个降钙素基因之间用一段编码柔性连接肽的DNA连接),并在大肠杆菌GI724中表达。Western blotting结果显示,串联多肽具有人源降钙素的抗原性。

鱼类生长激素的异源表达、应用及安全性评价

鱼类生长激素对鱼的生长发育起着重要的调节作用,能促进鱼体快速生长,提高饵料转化率,在水产养殖业中具有重大应用价值。转生长激素基因鱼具有快速生长效应,可以缩短养殖周期,降低养殖成本和风险。鱼类生长激素基因异源表达体系的建立和发展,使获得大量廉价的鱼类生长激素产品成为可能,为鱼类养殖业新型饵料添加剂的研制开辟了新的途径。本文综述了转生长激素基因鱼和鱼类生长激素基因的异源表达两方面的研究及其安全性评价。