羊膜组织细胞在再生医学领域的研究与应用

在机体损伤和疾病康复过程中，受损组织和器官的修复与重建一直是生物学和临床医学面临的重大难题。据报道全世界每年约有上千万人遭受各种形式的创伤，有数百万人因疾病康复过程重要器官发生纤维化而导致功能丧失。一直以来对于只采用药物疗法而不能得以恢复的严重损伤，不得不依靠人工脏器或脏器移植来解决。

533株葡萄球菌的分离鉴定和耐药性分析

目的:对广东省人民医院临床分离出的葡萄球菌的耐药情况进行统计分析,以便有效控制致病性葡萄球菌的临床感染及减少细菌耐药性产生,为临床经验用药提供有效依据。方法:从医院患者各类送检标本中分离出的533株葡萄球菌,按美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)的标准,采用纸片琼脂扩散法进行药敏试验。结果:葡萄球菌的耐药性均比较高,特别是MRSA和MRSCN,但在MRSCN中,对氨苄青霉素、阿莫西林/棒酸的耐药性较低,分别为43.7%、22%,不及MRSA高。结论:葡萄球菌是造成医院感染的主要病原菌之一,该菌耐药性的监测对指导临床合理使用抗生素、有效治疗疾病和控制医院感染的发生至关重要。

核因子-κB在环孢素A致人肾小管上皮细胞损伤中的作用

目的:探讨NF-κB在环孢素A(CsA)致肾毒性中的作用。方法:实验共分3组:CsA组,CsA+PDTC组及正常对照组,分别以CsA浓度为0、0.1、1、10mmol/L作用于培养的人肾小管上皮细胞,其中加入NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDCT)。用流式细胞术检测细胞线粒体膜电位的变化;用免疫组化结合激光共聚焦扫描显微镜检测NF-κB。结果:CsA组细胞线粒体膜电位下降,加入PDTC膜电位没有下降。CsA激活人肾小管上皮细胞NF-κB表达。结论:在CsA导致的肾小管上皮损伤中NF-κB被激活,阻断它的激活能减轻损伤的发生。

常山酮对人急性单核细胞白血病细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响

目的:研究常山酮对人急性单核细胞白血病(THP-1)细胞增殖、凋亡及Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响。方法:取对数生长期的THP-1细胞,分别加入不同浓度的常山酮,CCK-8法检测THP-1增殖率;流式细胞术检测THP-1凋亡情况;实时定量PCR检测Bax及Bcl-2 mRNA的表达情况。结果:常山酮能抑制THP-1细胞增殖、诱导其凋亡,呈剂量依赖关系。常山酮作用后,THP-1细胞内Bax mRNA表达显著升高,而Bcl-2 mRNA表达显著下降。结论:常山酮能抑制THP-1细胞增殖、诱导其凋亡,其作用机制可能与上调Bax mRNA表达、下调Bcl-2 mRNA表达相关。

锆钛酸铅对苯基硅橡胶阻尼性能的影响

通过原位聚合制得聚苯胺(PA)包覆锆钛酸铅(PZT)(PA-PZT),然后将导电炭黑(CB)与PZT(或PA-PZT)填充于苯基硅橡胶,表征了PZT、PA-PZT、苯基硅橡胶的相态结构,考察了CB、PZT、PA-PZT对苯基硅橡胶阻尼性能的影响,研究了填充苯基硅橡胶的物理机械性能。结果表明,在PZT或PA-PZT填充苯基硅橡胶中,粒径小于1μm的CB颗粒分布在PZT或PA-PZT周围,且分散均匀;加入CB后,随着振幅的增加,苯基硅橡胶的损耗因子(tanδ)呈现先增大后减小的趋势,CB的适宜用量为30份;当温度为-50～100℃时,加入PZT或PA-PZT后,苯基硅橡胶的阻尼值和温域同时增大,在大振幅和相同填充量下,填充PA-PZT橡胶的tanδ值比填充PZT者约大0.15,说明表面包覆更有助于硅橡胶阻尼性能的提高;随着PA-PZT用量的增加,苯基硅橡胶的tanδ提高,PA-PZT的适宜用量为80份;填充80份PZT或PA-PZT后,苯基硅橡胶的邵尔A硬度提高,扯断伸长率与拉伸强度有所下降,但拉伸强度仍可超过3 MPa。

鼻咽癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

构建人鼻咽癌组织cDNA文库 ,以SEREX方法从cDNA文库中筛选鼻咽癌抗原基因。采用确诊鼻咽癌患者新鲜活检癌组织构建cDNA文库 ,测定原始文库滴度 ,进行蓝白筛选以确定文库的重组率。以建库组织来源患者的自身血清 ,采用“一对一”的血清学方法筛选所构建的cDNA文库 ,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析。经测定原始文库滴度为 7 2 8× 10 6 pfu mL ,含 3 6 4× 10 6 个重组子 ,重组率为 94 % ,扩增文库滴度为 3 8× 10 9pfu mL ,cDNA插入片段大小在 0 5～ 3 0kb之间。文库经三轮血清学筛选共获得 2 3个阳性克隆 ,分别代表了 16个独立的cDNA插入片段 (抗原基因 )。其中 10个与已知基因高度同源 ,另外 6个基因与GenBank中已知基因的部分同源 ,其中有 3个是新基因。利用SMART技术构建了高质量的人鼻咽癌组织cDNA表达文库 ,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究。应用SEREX技术初步筛选鼻咽癌组织cDNA文库 ,共得到 16个鼻咽癌相关抗原基因 ,其中有 3个是新基因 ,可能为鼻咽癌的免疫学研究提供新的研究分子。

CCK-8和MTS法检测人羊膜上皮细胞增殖的比较

目的探讨CCK-8、MTS两种不同的四唑盐试剂在羊膜上皮细胞增殖检测中的最适实验条件,并比较两者细胞毒性。方法取体外培养对数生长期羊膜上皮细胞,用完全培养基（DMEM/F12＋10%胎牛血清）配制成不同浓度的细胞悬液加入96孔板中培养24 h,分别加入CCK-8、MTS后于450 nm、492 nm波长处测定光密度（OD）。在同一细胞浓度下,根据同一波长不同时间检测的OD确定CCK-8的最佳孵育时间。取体外培养的对数生长期羊膜上皮细胞分别用DMSO、CCK-8、MTS处理1 h、2 h、3 h和4 h后,继续培养24 h,在450 nm处以CCK-8检测细胞增殖,并通过台盼蓝染色计数活细胞数。结果 CCK-8法的最佳波长为450 nm,MTS法的最佳波长为492 nm。CCK-8法灵敏度稍低于MTS法。1~4 h内,CCK-8试剂与待检测细胞最佳孵育时间为4 h。CCK-8法对细胞增殖影响及细胞毒性均小于MTS法。结论 CCK-8法是一种更为方便、细胞毒性作用较小的试剂。

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的:采用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C3种物质作为诱导骨髓间充质干细胞(bonemarrow stromal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化的基本辅剂,定向诱导犬第2代BMSCs,探讨BMSCs向成骨细胞分化的潜能和成骨细胞的特征性鉴定方法。方法:无菌条件下行犬髂骨穿刺,采集骨髓15～20mL,全骨髓10%FBS DMEM培养液进行原代培养。将第2代纯化的BMSCs细胞悬液(调整细胞密度为1×105/mL)接种于含地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C的DMEM/FI2培养液的培养瓶(皿)中,体外扩增培养、传代。对细胞形态特征进行观察;行碱性磷酸酶(ALP)染色,骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白免疫荧光化学检测鉴定细胞性质。结果:原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长。诱导分化后的细胞形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大;BMSCs成骨诱导增殖后电镜下细胞呈多边形,可见ALP染色阳性;经成骨细胞诱导培养14d后,细胞骨桥素以及Ⅰ型胶原相关蛋白表达阳性。结论:BMSCs易于体外分离培养及扩增,地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C体外定向诱导能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。

人类羊膜细胞表达神经干细胞特异性蛋白研究

目的利用神经干细胞特异性标志蛋白鉴定人类羊膜组织中多分化潜能神经前体细胞的存在。方法利用免疫组织化学法检测人类羊膜组织和培养人类羊膜细胞中巢蛋白(nestin)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、musashi-1、波形蛋白(vi mentin)和PSA-NCAM等神经干细胞特异性标志蛋白的表达。结果人羊膜组织中存在nestin/GFAP双阳性细胞,此外,还表达musashi-1、vi mentin和PSA-NCAM等神经干细胞特异性标志蛋白;培养羊膜细胞中存在vi mentin和PSA-NCAM阳性细胞,以及nestin/GFAP双阳性细胞。结论羊膜组织和培养羊膜细胞中有神经干细胞特异性标记蛋白的表达。

人羊膜间充质细胞的神经生物学特性及其治疗帕金森模型小鼠的实验研究

目的评价人羊膜组织来源间充质细胞(hAMCs)的神经生物学特性及其脑移植对帕金森病(PD)小鼠的治疗观察。方法应用免疫细胞化学染色,通过间充质干细胞、神经干细胞、多巴胺能神经元和神经发生相关标记物Vimentin、STRO-1、nestin、CD133、β-tubulin、TH、DAT、Ngn2和mash-1抗体,鉴定在hAMCs中的表达;RT-PCR检测神经干细胞标记物Vimentin及nestin mRNA在hAMCs的表达。C57BL/6小鼠MPTP(i.p.)建立PD模型,将hAMCs移植到右侧纹状体内。通过自发运动和转杆实验以及抗人线粒体和TH抗体在脑纹状体免疫组织化学形态学,评价hAMCs对PD小鼠的治疗作用。结果经神经细胞培养基诱导培养后的hAMCs表达间充质干细胞、神经干细胞、多巴胺能神经元和上述所有与神经发生相关的特异性标记物。hAMCs移植后的PD小鼠自发运动次数增加(P<0.05),转杆时间延长(P<0.05)。结论hAMCs经体外诱导培养后具有神经细胞特性,移植到PD模型小鼠纹状体内能够改善MPTP所致的运动功能损伤。

人羊膜组织细胞的神经干细胞特性形态学研究

目的:利用形态学研究方法,探讨神经干细胞特异性标志蛋白的表达和增殖分化特性,鉴定人类羊膜组织中神经干/前体细胞的存在。方法:利用免疫组织化学法,检测人类羊膜组织和培养人类羊膜细胞中nestin、musashi-1、vimentin和PSA-NCAM等神经干细胞特异性标志蛋白的表达,利用BrdU掺入实验鉴定羊膜组织来源神经干/前体细胞的增殖分化能力。结果:免疫组织化学检测证实人羊膜组织表达nestin、musashi-1、CD133和vimentin等神经干细胞特异性标志蛋白,主要分布于羊膜组织的间质层。培养羊膜细胞的免疫荧光化学染色显示nestin、musashi-1、vimentin和PSA-NCAM阳性细胞的存在。BrdU掺入的组织形态学实验显示培养羊膜细胞中存在BrdU标记阳性细胞,其中具有BrdU与nestin、musashi-1、vimentin双标阳性细胞,显示羊膜细胞中存在具有增殖活性神经干细胞标记蛋白表达阳性细胞;而BrdU与β-tubullinIII、TH和GFAP双标阳性细胞的存在,表明神经元和胶质细胞是由培养羊膜细胞增殖分化的。结论:羊膜组织中存在神经干细胞特异性标记蛋白Nestin、Musashi-1、CD133、PSA-NCAM和Vimentin表达阳性细胞,BrdU掺入的组织形态学结果不仅证实羊膜细胞中Nestin、Musashi-1、Vimentin阳性细胞具有增殖活性,而且其中存在已分化的神经元和胶质细胞,提示羊膜组织细胞内存在神经干/前体细胞。

体外培养人羊膜间充质细胞的神经生物学特点

目的:探讨体外培养人羊膜间充质细胞(hAMCs)的神经生物学特征。方法:应用MTS分析法、BrdU掺人法和增殖细胞核抗原(PCNA)的免疫荧光染色.探讨体外培养hAMCs的增殖活性。利用免疫细胞化学法检测hAMCs中间充质细胞标记(STRO-1、Vimentin)、神经干细胞标记蛋白(Nestin、PSA-NCAM)、神经细胞标记蛋白(β-tubulin-Ⅲ、TH)和神经分化相关蛋白(math-1、mash-1)的表达。结果:MTS分析法显示hAMCs在接种后第6-8天增殖速度最快,第8-24天活细胞数基本保持稳定;BrdU和PCNA的免疫荧光染色结果显示体外培养hAMCs中具有大量BrdU和PCNA阳性细胞存在;体外培养的hAMCs表达间充质干细胞特异性标记物STRO-1和Vimentin,也表达神经干细胞标记物Nestin和PSA-NCAM,同时还可见神经元特异性标记物β-tubulin-Ⅲ和TH,以及神经元分化相关蛋白math-1和mash-1的表达;体外培养hAMCs中存在有TH/BrdU和β-tubulin-Ⅲ/BrdU双阳性细胞。结论:体外培养的hAMCs表达间充质干细胞、神经干细胞、神经元的特异性标记蛋白,同时具有增殖活性:hAMCs表达神经元分化相关蛋白。

人羊膜组织细胞神经生物学特性形态学研究

目的利用神经干细胞特异性标志蛋白,鉴定人羊膜组织中神经细胞的存在,从组织和细胞形态学角度探讨羊膜组织细胞的神经生物学特性。方法利用TH、AchT、NeuN、MAP2、CNPase、MBP和GFAP单克隆抗体,通过免疫组织化学、免疫细胞化学和免疫荧光细胞化学技术方法,检测羊膜组织细胞中的多巴胺能神经元、胆碱能神经元、神经元、少突胶质细胞和胶质细胞。结果羊膜组织细胞中存在TH、AchT、NeuN、MAP2、CNPase、MBP和GFAP等神经细胞特异性标记蛋白表达阳性细胞。结论实验结果提示羊膜组织细胞内可能存在多巴胺能神经元、胆碱能神经元少突胶质细胞和星形胶质细胞等。这对细胞移植治疗帕金森氏病、老年痴呆和多发性硬化等神经系统疑难疾病将具有一定的临床意义。

固本止咳中药对COPD模型小鼠肺组织中角质细胞生长因子表达的影响

目的观察固本止咳中药对COPD模型小鼠肺组织中角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor,KGF)表达的影响,探讨其治疗COPD的作用机制。方法采用鼻腔滴入LPS加熏香烟的方法建立COPD小鼠模型,实验分为空白对照组、模型对照组、固本止咳中药组;运用免疫组化方法检测小鼠肺组织中KGF表达水平,ELISA方法检测小鼠肺组织匀浆上清液中KGF的分泌水平。结果肺组织中KGF表达检测显示,模型对照组较空白对照组明显减少(P<0.05),经固本止咳中药治疗后,固本止咳中药组较模型对照组明显升高(P<0.05)。结论固本止咳中药促进COPD模型小鼠肺组织黏膜损伤的修复作用的机制之一是通过促进KGF的分泌实现的。

PAI-1基因多态性对哮喘气道重塑影响的研究

目的探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)基因启动子-675 4G/5G多态性对哮喘气道重塑的影响。方法慢性持续期哮喘患者(30例)和健康人(20名)分列为轻度哮喘组、中重度哮喘组和健康人组,用等位基因特异性PCR(ASO)法测定PAI-1启动子区域-675位点多态性,ELISA法测定血浆PAI-1、TGF-β1和MMP-9水平,高分辨率CT(HRCT)观察所有受试者肺部影像学特征,运用PickerPQ6000分析软件测定气道壁厚度(T)、气道壁面积(WA),采用气道壁厚度/气道外径(T/D)和气道壁面积占气道总面积百分比(WA%)作为标化指标。结果PAI-1的4 G/4 G、4 G/5 G和5 G/5 G 3种基因型表达的TGF-β1、T和WA%差异有统计学意义(P<0.05)。血浆PAI-1仅与血浆TGF-β1存在相关关系(r=0.335,P<0.05),与T、T/D、WA和WA%无相关关系(P>0.05)。多元方差分析显示PAI-1基因多态性、血浆TGF-β1、血浆PAI-1水平与PAI-14G/5 G基因多态性的交互作用对气道重塑表型的影响有统计学意义(P=0.050,P=0.026,P=0.030)。结论PAI-1启动子4 G/5 G多态性可能是哮喘气道重塑的独立影响因素。

新生大鼠低氧缺血性脑损伤对脑组织病理形态和神经营养因子的影响

目的改进新生大鼠低氧缺血性脑损伤(HIBI)模型的制作方法,观察低氧缺血对脑组织病理形态和神经营养因子的影响。方法大鼠随机分为空白对照组(n=5)、假手术组(n=8)和HIBI模型组(n=19),HIBI模型制作中省去了经典Rice法中的麻醉步骤和动物手术后休息时间,观察HIBI后大鼠体重增长情况,行为能力表现以及脑组织病理形态学改变;比较HIBI制模后3 d假手术组及HIBI组鼠脑匀浆beta-NGF和human-NT3的变化。结果 (1)HIBI模型组体重增长明显落后于空白对照组和假手术组(P<0.01);(2)HIBI组全部出现不同程度的行为异常:84%翻身不能,63%肌肉颤动和/或头颤,抽搐者占42%,死亡率为21%。制模后3 d HIBI模型组大鼠的行为障碍和异常运动的发生率均明显低于制模当日(P<0.01);(3)HE染色可见HIBI模型组大鼠左侧大脑半球神经元损伤及神经胶质细胞增生;(4)制模后3 d鼠脑匀浆human-NT3含量较假手术组增加(P<0.05);β-NGF含量无明显变化。结论制作的新生大鼠HIBI模型更符合临床新生儿HIBI的自然病程。HIBI早期神经营养因子表达增加在神经保护机制中发挥重要作用。

老年哮喘患者外周血淋巴细胞内IL-4与IFN-γ的变化及意义

目的:了解老年哮喘患者外周血淋巴细胞内IL-4、IFN-γ的变化及其在支气管哮喘发病中的意义。方法:选择老年哮喘患者分为急性发作期组和缓解期组,以健康老年人为对照组,应用流式细胞仪测定外周血淋巴细胞表达IL-4、IFN-γ的百分率,同时行肺功能检查。结果:CD4+淋巴细胞IL-4表达百分率3组各为(2.6±2.2)%、(1.3±0.9)%和(1.5±0.8)%,急性发作期组高于缓解期组(P<0.05)和对照组(P<0.05);IFN-γ表达百分率3组各为(10.5±4.6)%、(17.5±3.8)%和(18.4±5.9)%,急性发作期组低于缓解期组(P<0.05)和对照组(P<0.05);CD8+淋巴细胞IFN-γ表达百分率3组各为(26.4±10.3)%、(20.2±12.3)%和(21.3±10.4)%,急性发作期组显著高于缓解期组(P<0.05)和对照组(P<0.05)。1秒钟用力呼气容积占用力肺活量比值(FEV1%)与CD4+淋巴细胞IFN-γ表达百分率显著正相关(r=0.48,P<0.05),与CD4+淋巴细胞IL-4表达百分率及IL-4+/IFN-γ+比值呈负相关(r分别为-0.53和-0.65,P皆<0.01)。结论:Th1/Th2失衡,即Th1亚群的功能低下与Th2亚群的功能亢进,可能与老年哮喘患者病情发展有关。

犬骨髓基质干细胞源性血管内皮样细胞的诱导分化及细胞特征鉴定

目的采用血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导犬骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs),探讨BMSCs向内皮细胞(endothelial cells,ECs)分化的潜能和内皮细胞的特征性鉴定方法。方法采集犬髂骨骨髓15～20 mL,全骨髓10%FBS DMEM培养液进行原代培养。将第2代纯化的BMSCs细胞悬液接种于含VEGF、bFGF的DMEM/F12培养液(细胞接种密度为1×106.mL-1)体外诱导培养。对细胞形态特征进行观察,对诱导分化的细胞行CD31、vWF、VEGFR-2荧光免疫蛋白检测。结果原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长。诱导分化后的细胞光镜下单层融合生长,呈铺路石样形态;电镜下细胞呈多边形,可见特征性的Weibel-Palade小体;经成血管内皮细胞诱导培养7～14 d后,BMSCs诱导分化细胞CD31、vWF和VEGFR-2的表达呈阳性。结论犬BMSCs易于体外分离培养及扩增,经VEGF、bFGF体外定向诱导后的细胞具有血管内皮细胞的特征且细胞纯度高、数量大。

风心病患者体外循环瓣膜置换术前后细胞免疫功能的变化

目的 :观察风心病患者术前细胞免疫功能状况及体外循环瓣膜置换术对患者细胞免疫功能的影响。方法 :利用流式细胞术分别测定健康正常人、风心病患者术前及术后 1、4、8d的细胞免疫指标 ,并进行统计学分析。结果 :风心病患者与健康正常人相比 ,仅淋巴细胞差异有显著性。患者术后第 1天CD3 + 、CD4+ 、CD8+ 、CD4+ /CD8+ 值较术前显著下降 ,术后 8d除CD8+ 细胞外 ,其余基本恢复正常 ,但NK细胞术后第 1天无明显变化 ,第 4天显著降低 ,第 8天仍未恢复正常。结论