应用实时定量PCR技术研究人重组干扰素α2b在人群中对麻疹病毒和风疹病毒的抑制作用

Human recombinant interferon α2b can inhibit replication of many viruses and it is an important prophylactic drug for virus infection. In this study, interferon α2b was used to study the biological function on measles virus and rubella virus replication in human. For each virus, selected population was divided into two groups, including with and without interferon α2b treatment, then the attenuated viral vaccine was used to inoculate each group and the respiratory samples were collected at fixed intervals. A highly sensitive and accurate Real-time PCR method was used to detect the virus copy number in samples. The results showed that the virus copy number was much lower after interferon treatment and suggested that interferon α2b could inhibit the measles virus and rubella virus replication in human.

一种敏感的H5禽流感病毒血凝抑制试验方法

目的建立一种敏感的禽流感病毒血凝抑制方法检测H5禽流感病毒特异性抗体。方法采用不同动物来源的红细胞,用血凝抑制试验测定H5禽流感病毒特异性抗体,比较其灵敏性。结果通过对鸡、豚鼠、马等动物红细胞的比较,发现在采用血凝抑制试验测定H5禽流感病毒抗体时马红细胞灵敏度最高。结论可以利用马红细胞建立测定H5禽流感病毒血凝抑制抗体的敏感方法,该方法可以用于人群中禽流感病毒血清抗体水平的调查。

乙型流感病毒的分子生物学

乙型流感病毒是目前为止发现只感染人的一种正粘病毒，同甲型流感病毒一样会造成人的呼吸道感染并导致流行。乙型流感病毒无亚型之分，其基因的变异只有由于点突变或多点突变或掉失或插入所造成的抗原性漂移，而没有由于基因重配所造成的抗原性转变，并且其基因进化速度比人甲型流感病毒要慢２～３倍。其基因特性同甲型流感病毒有相似之处，但也有其自身的特点。

1995～2005年中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行相关性研究

为了探讨中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行关系，对1995～2005年中国分离的550株H3N2流感病毒的HA1序列进行分析。HA1基因进化树显示出以很长的主干和很短的侧枝为特征。HA1的氨基酸位点变异主要位于5个已知的抗原位点及其附近，同时其它位点也有改变。通过对HA1序列资料分析发现这期间导致H3N2流行的序列改变的三种可能，第一种是同时出现多位点变化，第二种是位点变化逐渐发生累积到多个位点变化，第三种是单个抗原位点和受体结合位点同时改变，均可以引起H3N2流行。

中国流感监测网络发展概况

流行性感冒（Influenza，流感）是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，临床表现为起病急、高热、肌痛、头痛伴有严重不适、干咳、咽喉痛或鼻炎，多数患者可在一到两周内恢复。流感潜伏期短、经呼吸道飞沫传播，传播迅速，抗原易变异。人群对变异株普遍易感，控制难度大。流感流行呈一定季节性，

移动流行区间法在我国北方15省份流感流行阈值制定中的应用效果评价

目的介绍移动流行区间法的基本原理,评价其在我国北方15省份流感流行阈值制定中的应用效果。方法利用中国流感监测信息系统收集中国北方15省份2010-2014年的流感监测数据。为不提及具体省份名称,用字母A^O分别代替15个北方省份。应用移动流行区间法制定各省份的流感流行开始和结束阈值,利用灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值四个指标评价该方法的应用效果。结果移动流行区间法得到的北方15省流感流行开始和终止阈值波动较大,开始阈值介于3.27%~18.03%,结束阈值介于5.04%~17.68%。其中8个省份的流行开始和结束阈值非常接近,但在3个省份相差很大。15省份平均灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值不高,平均值分别为54%、81%、65%和73%,但在5个省份的应用效果较好(灵敏度≥60%,特异度>80%)。结论移动流行区间法对我国北方5个省份流感流行阈值制定的应用效果较好,但对其他北方省份的效果相对较差,表明该方法还有改进的余地。

1981～2005年中国H1N1甲型流感病毒血凝素基因的HA1演变特征

为了解1981～2005年我国H1N1甲型流感病毒血凝素基因的HA1演变特征，选取H1N1甲型流感病毒370株，提取病毒RNA，经逆转录和聚合酶链反应扩增HA1并测序，测定的序列用生物信息软件分析，与GenBank中相关序列比较，并对推导的编码氨基酸序列进行基因特性分析。结果表明：HA1氨基酸的变异表现为抗原决定簇4个区均有变异，Sb区和Ca区变化较大；HA1受体结合位点（RBS）的前壁130环的第134位赖氨酸从1991年起在部分毒株HA1序列上开始缺失，以后缺失株逐步增多，自2000年起测定的所有毒株上该氨基酸全部缺失，同时这些缺失株的第137位氨基酸也全部由苏氨酸替换为丝氨酸；糖基化位点从增多到减少，最后稳定在7个；1981～2004年我国H1N1甲型流感病毒血凝素HA1编码的氨基酸在种系发育树上同年代基本呈现集中分布，与时间和地域无关，2005年毒株分成两个分支在时间上有明显差异。

全球B型流感病毒耐药相关突变株NA和HA序列特征分析

目的研究全球B型流感耐药相关突变株的NA和HA序列特征及分子结构特点。方法对我国2008-2012年B型流感病毒进行序列测定和分析,确定耐药相关突变株,进一步利用MEGA5.0软件分析我国与全球其他国家B型流感病毒的耐药相关突变位点和伴随位点的异同,并构建系统进化树,利用RasWin软件在NA、HA蛋白分子模型中展示突变位点。结果我国2008-2012年共发现6株B型流感病毒耐药相关突变株,其携带的NA、HA伴随突变较少,且与国外B型耐药相关突变株的NA、HA序列处于不同的进化分枝上。结论目前发现的B型耐药相关突变株的突变位点多种多样,且我国的B型流感病毒耐药情况与国际情况并不十分一致,这提示加强我国乃至全球B型流感病毒耐药监测的重要性。

采用基因微阵列技术对常见呼吸道病毒进行检测的初步研究

建立一种高通量的基因微阵列检测技术,对常见呼吸道病毒感染进行监控。根据公开发表的8个病毒科38种常见呼吸道病毒的序列,计算其保守区域,设计病毒的特异性检测探针,制备呼吸道病毒检测基因微阵列。利用随机引物PCR方法标记样品中的病毒靶序列,标记产物与基因微阵列上的探针杂交,清洗、扫描后进行结果分析。采用流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒作为报告病毒,并对80例上呼吸道感染患者的咽拭子标本进行验证测试。初步结果表明,该呼吸道病毒微阵列基因芯片检测是可行的,在利用基因微阵列技术对病毒监控方面进行了有益的尝试,得到了有经验的信息。

1996～2005年中国H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶基因特性分析

测定了1996～2005年间在中国分离并保存的395株H3N2亚型人流感病毒神经氨酸酶（NA）基因序列，应用生物信息学工具进行了分析。结果表明：NA基因序列的进化树表现为一主要进化主干伴随多侧分支进化，同一年份的毒株可以分为几个分支存在；疫苗株在NA基因序列进化树上存在明显的滞后现象；NA没有氨基酸的丢失与插入；抗原决定簇大部分位点保守且各抗原决定簇之间的变异情况各有特点，其中197～199位、431～434位和339～347位点的变异频率最高，而153位、328～336位、367～370位、400～403位抗原决定簇的氨基酸变异频率相对比较小；除了抗原决定簇外还有些氨基酸位点的变异频率很高，它们分别是18、23、30、93、143、208、216、221、249、265、267、307、385、437位氨基酸，其中143位和267位这两个位点的变异频率高于抗原决定簇位点，具体生物学意义还需要进一步研究；NA蛋白的酶活性中心位点高度保守；二硫键和糖基化位点保守。NA基因的这些特点为流感的预防、控制以及NA抑制剂药物的应用提供了一定的参考依据。

人H5N1亚型禽流感病毒安徽株NS1基因的克隆及在原核系统的表达

利用RT-PCR方法,从人H5N1亚型禽流感病毒安徽株扩增到了NS1基因,对其进行了克隆、序列测定和分析,并在原核系统高效表达和纯化了NS1蛋白.进化分析表明,A/Anhui/01/2005毒株与近些年国内分离的水禽H5N1病毒进化关系更为接近.NS1与福建、湖南分离的禽流感病毒同源性最高,分别达到99.1%和98.2%.序列分析表明,与病毒的致病性相关的92位氨基酸为Asp,与病毒的细胞因子抗性相关的80～84位氨基酸发生缺失,与断裂/多聚腺苷酸化特异性因子结合的基序改变为GFEWN,和病毒致死性相关的PL基序为ESEV.随后在大肠杆菌高效表达并纯化了NS1蛋白.Ns1基因及其编码产物的特性分析以及在原核系统的表达,为进一步研究NS1的致病机制和抗病毒药物研制奠定了基础.

单纯疱疹病毒I型扩增子系列载体的构建

我们先前已报道了构建成一种能在ＨＳＶｔｓＫ株辅助下进行复制和包装，并表达β－半乳糖苷酶基因ｌａｃＺ的ＨＳＶ－１扩增子质粒ｐＨＳＬ，以及它的应用〔１〕。该质粒中依次含有ＨＳＶ－１复制起点ｏｒｉＳ序列及ＩＥ６８启动子、ｌａｃＺ基因、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＨＳＶ－１包装信号‘ａ’序列和大肠杆菌质粒骨架。然而，该质粒中的报告基因ｌａｃＺ无法用简单的酶切方法卸载下来，继而装入目的基因。本研究在此基础上，新构建了一系列质粒型单纯疱疹病毒载体。首先构建了ＨＳＶ－１扩增子载体质粒ｐＨＳＶＩＥ６８，在ＩＥ６８启动子的下游带有可供外源基因插入的ＨｉｎｄⅢ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ等克隆位点，其后没有ｐｏｌｙＡ加尾信号。为检验ｐＨＳＶＩＥ６８载体的有效性，将报告基因ｌａｃＺ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ片段通过ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨＩ位点插入该载体中，构建成重组扩增子质粒ｐＨＳＶ－ｌａｃＺ１。将该质粒转入ＢＨＫ细胞，并辅以ＨＳＶ－１ｔｓＫ株病毒感染，３１℃培养４８～７２小时后收获的细胞上清感染新鲜的ＢＨＫ细胞，用Ｘ－ｇａｌ液染色可见有大量细胞蓝染，提示所构建的ｐＨＳＶＩＥ６８质粒能有效地工作。在此基础上，我们又构建了含有ＳＶ４０ｐｌｏｙ?

人高致病性禽流感病毒H5N1安徽株HA、M2蛋白双顺反子表达载体的构建及表达研究

将我国分离的人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和M2基因片段并克隆至DNA疫苗表达载体pVRC中,构建成真核表达质粒。为提高HA的表达量,按照人偏爱密码子将HA基因进行优化改造,经全基因合成后插入真核表达载体pVRC,以β-actin蛋白为内参比证明了优化后的HA蛋白表达效果明显提高。将M2基因和优化后的HA基因共同克隆入双顺反子表达载体pIRES中,获得同时表达HA或M2的双顺反子真核表达质粒;通过Western blot和间接免疫荧光检测方法,确认构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和M2。通过上述结果为进一步开展人高致病性禽流感病毒安徽株HA和M2基因的功能与致病性研究及使用表达HA和M2蛋白进行新型人用禽流感双价疫苗研发奠定基础。

人源中和性抗高致病性禽流感病毒H5N1基因工程全抗体的研制

运用噬菌体表面呈现技术,从禽流感病人恢复期血中获得淋巴细胞,通过基因工程手段,构建了人源抗H5N1禽流感病毒基因工程抗体文库。用纯化的人源H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)及重组血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,成功地获得了抗禽流感病毒H5N1血凝素蛋白HA的人源单抗Fab段基因,并在大肠杆菌中获得有效表达。通过序列测定确定抗体轻重链型别,然后将阳性克隆的轻链和重链Fd段基因分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达。用ELISA、IFA和流式细胞术对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。结果表明,我们获得了2株特异性针对H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应的人源单抗(AVFluIgG01、AVFluIgG03)。微量中和试验结果表明,除A/Guangdong/1/2006外,AVFlu-IgG01能够广泛地中和HA基因进化上属于Clade2的中国南方、北方及中部地区的H5N1禽流感病毒分离株,同时还对属于CladeⅠ的越南H5N1分离株A/VietNam/1203/2004具有中和活性;AVFluIgG03虽然不能中和A/VietNam/1203/2004,但是对属于Clade2的所有中国H5N1分离株均具有中和作用。人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程全抗体的获得不仅为高致病性禽流感病毒H5N1的预防和治疗带来了希望,同时也为其疫苗研制提供了新的思路。

厄尔尼诺-南方涛动现象与流行性感冒联系的系统评价

目的调查分析既往及正在执行的厄尔尼诺-南方涛动现象(El Ni1o-Southern Oscillation,ENSO)与流行性感冒关联的相关研究,并评价ENSO对流行性感冒相关指标(如流感流行高峰的出现时间、流感样病例报告人数等)的影响,为进一步开展天气及气象因素影响流感病毒传播研究提供依据和建议。方法计算机检索MEDLINE,EMBASE,Science Direct,HEED、中国生物医学文献数据库(CBMdisc)、万方学位论文全文数据库,查找1988~2016年10月已发表的关于ENSO与流行性感冒联系的文献,并运用循证医学方法进行文献数据提取和分析。结果共检索到78篇文献,其中符合纳入标准的已发表文献10篇。二次文献研究显示,出现ENSO与流感大流行的发生,流感高峰的出现时间,流感样病例就诊数及重症死亡数都有较大关联,且El Ni1o和La Ni1a现象对流感相关指标的影响也不尽相同。结论从纳入研究的已发表文献分析结果来看,ENSO与流行性感冒相关指标之间有较强的相关性。

人H5N1流感病毒血凝素蛋白DNA疫苗的构建及其免疫原性研究

将我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和HA1基因片段并克隆至真核表达载体pStar,构建成真核表达质粒。通过Western blot和间接免疫荧光检测方法确认,构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和HA1。将重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测免疫后外周血中HA/HA1特异性抗体的效价,并比较HA和HA1的免疫原性。结果表明,重组质粒免疫后成功地诱导了体液免疫反应,且二者的血清抗体效价无显著性差异。

猪流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定猪流感病毒H1N1 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆猪流感病毒H1N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短),pET32a(+)/NA(截短),pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/Rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap 4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果显示,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western blotting试验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了猪流感病毒H1N1 HA、NA基因序列,为猪流感病毒H1N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。