坏死梭杆菌FN(A)p2001株小鼠感染模型的建立

将鹿源坏死梭杆菌FN（A）p2001分离株以3×10^8、3×10^7、3×10^6、3×10^5、3×10^4、3×10^3个／只等不同菌量，分别接种于6组小鼠，每组10只，逐日观察小鼠感染情况。结果表明，3×10^6、3×10^7、3×10^8个／只菌量感染组小鼠，在接种后3d～8d先后死亡，5d后死亡小鼠的病理变化明显，并从死亡小鼠内脏及脓汁中均检到长丝状及小杆状等多形态典型的坏死梭杆菌；3×10^4个／只和3×10^5个／只菌量感染仅表现体重减轻，3×10^3个／只菌量感染无明显临床表现。由此表明，坏死梭杆菌FN（A）P2001分离株具有很强的感染毒力；对小鼠的最小致死量为10^6个／只菌量；腹腔接种是适宜的感染途径。从而建立了坏死梭杆菌分离株小鼠感染模型。

坏死梭杆菌FN(A)型毒力株保护性抗原筛选及初步鉴定

通过胰蛋白酶裂解坏死梭杆菌FN(A)型毒力菌株菌体,分别以菌体裂解物上清和沉淀作为抗原免疫家兔制备血清。利用SDS-PAGE/Western-blot技术在菌体中筛选出4种具有免疫原性的组分,通过免疫后的攻毒试验,筛选出1种具有免疫保护性的抗原。抗原分离纯化后,进行N端氨基酸序列测定、免疫试验及生物学特性研究,据试验结果可初步判定该抗原为溶血素类似物或一种新发现的抗原物质。该抗原不仅能使机体产生保护性免疫反应,而且不同菌株中此种抗原间可产生明显的交叉免疫。

坏死梭杆菌病免疫学研究进展

长期以来,国内外研究人员一直致力于坏死梭杆菌的免疫性及免疫作用研究,但进展缓慢,主要原因是坏死梭杆菌免疫作用弱,无法产生保护性免疫。直到20世纪80年代末,对坏死梭杆菌免疫研究才有了新的突破,初步研制出坏死梭杆菌疫苗,并经小群动物试验获得成功。文章就坏死梭杆菌免疫性及免疫作用的初始研究、坏死梭杆菌免疫原筛选研究、抗原间的相互作用、疫苗研究进展进行了综述,并展望了坏死梭杆菌疫苗研究的发展趋势。

腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与表达

用 PCR从腐蹄病 C型节瘤拟杆菌扩增出具有免疫保护性抗原 0 .85 kb纤毛蛋白基因 (pili基因 ) ,并构建了该基因的表达载体。转化宿主细胞 PAK/2 pfs,在营养肉汤中进行 pili基因的表达。培养 18～ 2 4h后 ,收集培养液上清 ,加入 0 .1mol/L Mg Cl2 ,离心提取重组纤毛蛋白。用羊抗兔 C型节瘤拟杆菌抗血清与提取的纤毛蛋白进行对流免疫电泳试验 ,结果表达的重组纤毛蛋白有特异性 ;用 SDS- PAGE和 Western- blot证明表达的蛋白是 C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白。

腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因工程疫苗对家兔的免疫试验

将转化 C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因表达子粒的工程菌 PAK/ 2 pfs C在含羧苄青霉素营养肉汤培养基中培养 ,用 Mg Cl2 法在培养物上清中提取表达产物 (纤毛蛋白 )。将表达的纤毛蛋白产物用弗氏完全佐剂乳化 ,制成疫苗。用疫苗免疫 3只健康家兔 ,2 1 d后再次接种 ;定期采血 ,用对流免疫电泳和 K凝集实验检测试验家兔的体液免疫应答及抗体水平。结果发现 ,免疫 7d即可产生相应抗体 ,2 1 d后抗体效价达到 80 0 0×以上 ,而且高滴度抗体可维持 6个月以上。试验表明 ,腐蹄病

腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与表达载体的构建

用 PCR技术从腐蹄病 C型节瘤拟杆菌克隆出具有免疫保护性抗原 0 .85kb纤毛蛋白基因 ( pili基因 ) ,利用该基因构建了纤毛蛋白基因表达载体。提取 C型节瘤拟杆菌染色体DNA;用所设计的专一性引物进行 PCR,扩增出 pili基因 ;将 pili基因克隆于 TE载体 ,TE-pili重组质粒 pili基因序列测定结果正确 ,用 Eco R 酶切 ,低熔点胶回收 pili基因片段 ,经 klenow补平后 ,用 T4DNA连接酶将其与中间载体p PLλ连接 ,将 pili基因克隆于 p PLλ载体 ,经Bam H 、Bam H +Hind 、Dral酶切鉴定 pili基因正向插入 p PLλ载体 ;扩增 p PLλ-pili重组质粒 ,用 Bam H 酶切出 2 .1 kb大小片段 ,回收后 ,与 PME2 90表达质粒连接 ,转化宿主细胞PAK/ 2 pfs中 ,对获得的重组质粒用 Bam H 酶切 ,出现 2 .1 kb大小的带 。

绵羊白细胞介素2基因的克隆与表达载体构建

从绵羊血中分离白细胞,提取绵羊白细胞RNA,利用RT-PCR、PCR扩增绵羊白细胞介素2(OvineIL-2)基因。将OvineIL-2PCR产物与TE载体定向连接,用SaLI和BamHI双酶切重组TE,利用低溶点胶回收500bp大小的片段;将其补平后与PPSD质粒连接,用EcoRI酶切鉴定,找出正向连接重组质粒。用BamHI酶切重组PPSD质粒,低熔点胶回收2500bp大小的片段;将其与经BamHI酶切去磷酸化的PME290表达质粒连接,筛选出阳性重组PME290,即为OvineIL-2基因表达载体。

腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与序列分析

提取C型节瘤拟杆菌染色体DNA。用PCR技术从腐蹄病C型节瘤拟杆菌克隆出具有免疫保护性抗原 0 .85kb纤毛蛋白基因 ( pili基因 ) ,将PCR产物pili基因克隆于TE载体 ,在含X - gal和IPTG的AmpLB平板上 ,挑选白色单一菌落进行质粒的筛选 ,用EcoR1酶切提取重组质粒 ,琼脂糖凝胶电泳 ,出现一条 0 .85kb的条带 ,从而筛选出TE - pili重组质粒。对 pili基因进行序列测定 ,结果与国外报道的 pili基因序列一致。

牛传染性鼻气管炎病毒JZ06-8株犊牛感染模型的建立

为建立IBRV对犊牛的感染模型,将试验组第1组~3组犊牛通过鼻腔内喷雾接种4mL/头,病毒含量分别为107.0 TCID50/mL、106.0 TCID50/mL和105.0 TCID50/mL的IBRV/JZ06-8,阴性对照组同样方法接种MDBK细胞冻融物;攻毒后第0天~第14天,每天测定直肠温度,进行临床观察,采集鼻拭子进行病毒分离鉴定。结果显示,鼻内喷雾接种对犊牛可产生有效感染,106.0 TCID50/mL的感染剂量即可致犊牛产生典型的IBR临床症状,并可分离到IBRV。试验成功实现IBRV/JZ06-8对犊牛的感染,该模型可用于IBRV研究和IBR疫苗评价。

牛病毒性腹泻病毒研究进展

牛病毒性腹泻病毒是黄病毒科瘟病毒属的代表种,主要感染牛并引发疾病,造成严重的经济损失。自该病毒发现至今,已有60余年研究历史,随着生物学理论及技术不断发展,特别是反向遗传技术以及蛋白组学在病毒研究领域的应用,人们对该病毒产生了一些新的认识。论文从牛病毒性腹泻病毒的病毒粒子结构组成及功能、病毒复制周期及蛋白裂解过程、细胞损伤及免疫逃逸机制三个方面阐述了近几年牛病毒性腹泻病毒分子生物学研究的进展,重点讨论了病毒复制周期、多聚蛋白裂解、致细胞病变效应和免疫逃逸机制。

鹿坏死杆菌病的综合防治

主要通过疫苗免疫预防、临床治疗和日常预防与管理等方面 。

牛病毒性腹泻病活疫苗BVDV2/JZ05-1株毒力返强试验

研究了BVDV2/JZ05-1株免疫犊牛后是否会出现毒力返强现象。以病毒含量为10-7.26TCID50/mL的BVDV2/JZ05-1活疫苗滴鼻免疫犊牛(4mL/头),通过疫苗回滴,连续临床观察,采集抗凝血和鼻拭子,对淋巴细胞数量变化进行分析,并从淋巴细胞和鼻拭子中分离病毒。结果表明,BVDV活疫苗BVDV2/JZ05-1株免疫犊牛没有出现BVDV感染的临床症状,淋巴细胞数量正常,鼻拭子和淋巴细胞病毒分离阴性。可见,该毒株对犊牛免疫没有出现毒力返强的现象。

食品和动物性饲料中沙门氏菌PCR检测方法的建立

为建立食品及动物性饲料沙门氏菌的PCR快速检验方法,设计出一对特异性引物,分别对鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌以及多种非沙门氏菌的肠道病原菌进行了PCR扩增。结果,沙门氏菌出现300 bp的条带,其他非沙门氏菌无条带,证明该对引物特异性良好。利用人为污染沙门氏菌的方法,对鱼罐头、蛋制品、鱼粉、肉骨粉进行不同程度地沙门氏菌人为污染,对样品进行适当处理后进行PCR检测。结果,鱼罐头、鱼粉、蛋制品、肉骨粉均能达到理想检测效果,敏感性为10～100 CFU/50 L。利用该方法对商品鱼罐头、蛋制品、鱼粉、肉骨粉进行检测,具有检测速度快、特异性强、敏感性高等优点。

沙门氏菌入侵因子基因保守序列的克隆与分析

分别提取鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌染色体DNA,用设计的专一性引物扩增沙门氏菌入侵因子基因保守序列,PCR产物经凝胶回收纯化,克隆于TE载体,在含X-gal、IPTG的Amp LB平板筛选阳性克隆,提取质粒进行酶切鉴定,对目的片段进行测序。结果表明,扩增出的序列与GenBank中发表的基因序列一致。通过Blast比对,发现从3种沙门氏菌菌株克隆出的片段所编码的氨基酸序列中,鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌相同,鸡白痢沙门氏菌与前两种相差1个氨基酸。

布鲁氏菌L7/L12、OMP31基因的克隆、测序及免疫原性分析

为研制鹿布鲁氏菌病工程疫苗,根据已发表的布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12、外膜蛋白OMP31基因设计两对引物进行扩增,PCR产物连接pGEM-Teasy载体,转化DH5α后测序,并进行基因分析。结果从布鲁氏菌疫苗株中克隆出L7/L12和OMP312个目的基因,同源分析L7/L12达97.1%,OMP31达100%,免疫原性分析可作为免疫优势抗原。

检测和鉴别流产布鲁氏菌与猪布鲁氏菌的复合PCR方法的建立

将GenBank上登录的流产布鲁氏菌(Br.abortus)和猪布鲁氏菌(Br.suis)外膜蛋白omp2基因序列进行比对,设计了流产布鲁氏菌特异性引物对A1/A2、猪布鲁氏菌特异性引物对S1/S2,分别用引物A1/A2和S1/S2进行PCR,进而将引物A1、A2、S1、S2置于同一体系内进行复合PCR,建立了一种能区分流产布鲁氏菌和猪布鲁氏菌的复合PCR鉴别诊断方法。应用该方法从流产布鲁氏菌和猪布鲁氏菌染色体基因组中扩增出了大小分别为424bp和535bp的1条特异性片段,从两种染色体基因组混合物中扩增出了大小为424bp和535bp的2条特异性片段。但对大肠杆菌、结核杆菌、坏死杆菌、棒状杆菌染色体基因组进行PCR扩增时均为阴性。该方法可以检测出10个菌/50μL体系。本研究建立的复合PCR可以有效检测布鲁氏菌感染并把流产布鲁氏菌和猪布鲁氏菌区分开。

牛病毒性腹泻病二价弱毒活疫苗制备工艺研究

研究了BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3二价弱毒活疫苗的制备工艺。通过对BVDV2/JZ05-1和BVDV1/JZ05-3疫苗毒传代培养测定毒价后,试制出5批毒价分别是105.4TCID50/mL和105.6TCID50/mL的BVDV二价弱毒活疫苗,经检验符合试验设计要求。

牛病毒性腹泻BVDV2/JZ05-1活疫苗最小免疫剂量及攻毒保护试验

本试验对牛病毒性腹泻病毒BVDV2/JZ05-1活疫苗对犊牛最小免疫剂量及攻毒保护效果进行了研究。对BVDV2/JZ05-1活疫苗进行倍比稀释后免疫犊牛,在免疫后第28天用BVDV/JL-1强毒株进行攻毒保护试验研究。结果表明,牛病毒性腹泻病毒BVDV2/JZ05-1活疫苗对犊牛的最小免疫剂量是105.0TCID50/mL。

布氏杆菌L7/L12和OMP31基因克隆及融合表达

本研究根据已经发表的布氏杆菌基因序列,选择种间序列极为保守的保护性抗原L7/L12、OMP31基因,依此进行PCR扩增,利用引物上设计好的限制性内切酶酶切位点进行基因重组,构建了PME290-SDLOmp高效表达载体,并转化绿脓杆菌(PAK/2pfs),通过培养得到了表达产物,对表达产物进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定,结果符合预期。本项研究为进一步开展布氏杆菌亚单位疫苗的研制奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒反转录及3'-末端克隆测序方法研究

牛病毒性腹泻病毒为黄病毒科瘟病毒属代表种,其基因组为单股正链RNA,无Poly(A)尾。传统的3'-末端快速扩增方法不适用于牛病毒性腹泻病毒的3'-末端克隆测序。本研究根据牛病毒性腹泻病毒基因组3'-末端共有特征碱基,设计回文锚定引物CGend。以BVDVJZ05-1毒株为研究对象,进行了反转录及3'-末端克隆测序。结果表明,CGend的反转录效果优于随机引物和一般特异性下游引物,并且扩增得到了JZ05-1的3'-末端完整序列。本研究为瘟病毒属病毒反转录和3'-末端克隆测序提供了新思路。