花粉管通道法验证花生Oleosin基因启动子的特异性表达

油体蛋白(Oleosin)是一类覆盖在油体表面且仅在种子中特异表达的低分子质量蛋白,能维护油体的稳定性。研究利用花生Oleosin基因的启动子替换了pCAMBIA1301的35S启动子,构建了重组表达载体pCAMBIA1301-Oleosin-pro,并利用花粉管通道法导入花生。对T0代转基因植株进行了PCR鉴定和GUS组织化学染色,结果显示:50株转基因植株有9株能扩增出目的条带,阳性率为18%,9株阳性转基因植株中有5株的子叶能被GUS染色。对GUS染色成阳性的转基因植株的子叶进行切片观察,结果显示Oleosin基因启动子驱动的GUS基因在油体蛋白中能够表达。

甘薯Ran基因的克隆和表达分析

Ran蛋白是小GTP结合蛋白家族成员之一,控制着蛋白和RNA分子的运输过程。研究发现有些Ran基因受多种逆境胁迫的诱导表达。为了获得甘薯Ran基因,本试验通过RT-PCR克隆了1个甘薯Ran基因。测序结果显示其含有长666bp的完整开放阅读框,编码的蛋白含221个氨基酸,推测分子量为25.15kDa。比对分析发现甘薯与多种生物的Ran蛋白的氨基酸序列同源性都超过90%,荧光定量PCR研究表明IbRan基因受低温、PEG、盐和植物激素ABA的诱导表达。这为利用基因工程手段调控甘薯的抗逆性奠定了基础。

农杆菌介导的花生遗传转化体系的优化

以花生胚小叶及其诱导形成的愈伤组织为转化受体,采用农杆菌介导法,通过评估外植体GUS基因瞬时表达率,优化花生遗传转化条件。结果表明,侵染液中添加表面活性剂2-氮吗啉乙烷磺酸(MES)150mg/L或烟草提取物0.5ml/30ml有利于提高胚小叶外植体GUS瞬时表达率;采用针刺法辅助农杆菌介导转化,其胚小叶外植体多点GUS瞬时表达率(29.1%)明显高于未针刺的对照(12.1%);利用愈伤组织作为转化受体,其多点GUS瞬时表达率高达70.1%。利用此优化体系进行花生遗传转化,获得的抗性苗2011年经嫁接、移栽于试验田,PCR检测获得了T0代转基因植株,2012年部分T1代植株也检测出目的条带。

离体筛选花生抗逆突变体及其后代特征特性研究

在课题组前期研究确立的花生体胚诱导及高频率植株再生体系和确立的适宜平阳霉素(PYM)诱变浓度基础上,进行花生离体诱变及定向筛选抗逆突变体研究。以花生品种花育20号成熟种子胚小叶为诱变材料,在含3mg/L PYM的诱导培养基上培养4周进行诱变处理。以羟脯氨酸(HYP)作为筛选压力添加于培养基中,确定体胚萌发阶段培养基中添加4mg/L HYP,以及体胚萌发后添加8mg/L HYP为适宜浓度的筛选方法。2011年将获得的HYP耐性苗经嫁接移栽田间,成熟后13株耐性嫁接苗获得种子。2012年将13个单株的部分种子分别播种于田间,生长发育阶段观察发现,12个耐性植株后代在株高、茎枝颜色、株型、开花习性等方面与诱变亲本不同,明显表现出变异,并且大部分植株后代性状发生分离。13个耐性单株中的7个单株收获的其他种子分别播种于塑料大棚,苗期进行干旱处理后,大部分植株生长正常,而诱变亲本的生长明显受到抑制;取干旱处理后的叶片测定POD活性和SOD活性,结果显示,这7个耐性单株中的5个单株后代SOD活性高于亲本,这5个单株后代中的4个POD活性也高于亲本。