巨桉转录因子ZF-HD基因家族及其功能初步分析

[目的]解析转录因子ZF-HD在桉树生长发育中的作用,进而深入了解其在桉树中如何发挥功能。[方法]在本研究中利用生物信息学鉴定巨桉ZF-HD基因家族成员,并对其染色体定位、理化性质、基因结构、蛋白保守结构域和表达模式进行分析。[结果]桉树中共发现10个基因家族成员,编码78~343个氨基酸,几乎所有成员都属于碱性蛋白质,主要定位于细胞核,且motif1在ZF-HD家族中非常保守,其启动子顺式作用元件主要为激素应答、生长发育和逆境应答等响应元件。ZF-HD基因家族成员在不同组织、不定根诱导和不定芽诱导过程中的表达分析表明,大多数家族成员在不同组织中存在着差异表达,且家族成员主要在顶端等初生生长阶段表达。且巨桉ZF-HD家族部分成员在不定根和不定芽诱导阶段表达量显著上升,亚细胞定位分析与预测结果相同。同时EgrZHD2定位于细胞核,且在茎尖的表达量较高,随着茎顶端向下其表达量显著下降。[结论]巨桉ZF-HD基因家族成员在桉树不定根和不定芽诱导等发育中起着重要的调控作用。EgrZHD2作为重要的转录因子作用于桉树的初生生长以及不定根诱导等生物学过程。

巨桉FLA基因家族成员的鉴定与分析

【目的】含有束状蛋白(fasiclin)结构域的类成束状阿拉伯半乳糖蛋白(fasciclin-like arabinogalactan proteins,FLAs)在巨桉细胞壁的次生生长和合成中起着重要作用。为了获得更多有价值的信息并探索其功能,对巨桉FLA基因家族的全基因组进行分析。【方法】以巨桉全基因组数据和转录组数据为基础,通过Expasy、MEME、MEGA7.0、TBtools等生物信息学工具对EgrFLAs基因家族的核酸序列的特征、基因结构、蛋白质理化性质、蛋白保守结构域、家族系统进化关系和表达量等进行分析和预测。【结果】巨桉共有21个EgrFLAs基因,其中包括3个新发现的EgrFLAs基因,这些基因不均匀地分布在巨桉11条染色体中的9条上。所有鉴定到的EgrFLAs基因均含有束状蛋白结构域,聚为4个群组,其中D组包含最多的基因成员。在EgrFLAs基因启动子中发现了大量的顺式元件,包括发育相关、水杨酸、茉莉酸甲酯等相关响应元件。不同组织的表达谱分析表明除EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3外,聚在A组的EgrFLA5和EgrFLA7也参与了次生生长。在巨桉不定根形成过程中,EgrFLA1和EgrFLA3通过表达量逐渐增加的方式参与诱导不定根形成。经SA和MeJA处理后,EgrFLA1和EgrFLA2的表达量发生显著变化,表明EgrFLA1和EgrFLA2在巨桉的发育和胁迫反应中可能具有多种作用。【结论】在巨桉中鉴定FLA基因21个,包括新发现的3个基因。在EgrFLAs基因启动子中发现了大量发育和激素相关的顺式元件。EgrFLA1、EgrFLA2、EgrFLA3、EgrFLA5和EgrFLA7作为巨桉次生生长发育中的候选基因,将为进一步的巨桉分子育种提供宝贵的资源。

巨桉EgrGBF1基因的克隆和表达模式分析

G-box结合蛋白(GBF)是一类能够识别并结合G-box的转录因子,广泛参与植物基因响应外界刺激的表达调控。通过巨桉(Eucalyptus grandis)初生生长到次生生长的转录组测序筛选出差异表达基因EgrGBF1,为探讨其在桉树生长发育中的功能,从巨桉中克隆了该基因,并进行了结构和进化分析。结果表明,EgrGBF1编码区长度为984 bp,编码327个氨基酸,存在2个转录本,分别命名为EgrGBF1α和EgrGBF1β。实时荧光定量PCR结果表明,EgrGBF1α和EgrGBF1β在不同组织中,不同激素、胁迫处理下的表达模式不同,EgrGBF1α主要在茎尖表达,沿节间向下表达量逐渐降低,而EgrGBF1β在韧皮部高表达,在节间的表达量无显著差异。在水杨酸和缺硼处理下,EgrGBF1α和EgrGBF1β的表达趋势相反。EgrGBF1α在缺磷处理168 h的表达量最高,而EgrGBF1β在处理6 h的表达量最高。因此,EgrGBF1在桉树生长发育以及响应胁迫中发挥着重要作用,且转录本EgrGBF1α和EgrGBF1β可能具有不同的功能。

伐桩高度对猴耳环人工药材林萌芽更新的影响

为探究不同伐桩高度对猴耳环人工林萌芽更新与生物量积累的影响,于2016年惠州市惠阳区良井镇前锋村,以480 d的猴耳环人工纯林为研究对象,分别采用30、60、90、120 cm的伐桩高度进行采伐,以去枝留顶和去枝截顶2种方式为对照,分析不同伐桩高度对伐桩萌芽率、存活率、萌条数、萌条生长和生物量等的影响。结果表明:伐桩高度120 cm的萌芽点数和萌条数量最多,伐桩高度90 cm的萌条长度和萌条生物量最大,与对照相比,伐桩高度对萌芽率和存活率没有显著影响,但对萌芽点数、萌条数、萌条基径、长度和生物量影响显著;伐桩的萌条数、基径、长度和生物量均随伐桩高度的增加呈现先增加后减少的趋势。总体而言,4种伐桩高度中,90、120 cm的伐桩在萌条数量、基径、长度和生物量方面萌芽更新效果最好。伐桩高度90~120 cm是猴耳环人工药材林适宜的采伐高度,可获得较大的萌芽林生物量。

修枝对滇南大花序桉人工林生长的影响

以云南卫国林业局小黑江大花序桉实生林为研究对象,以不修枝作为对照,分别采用修掉1/3树高以下分枝、1/2树高以下分枝及修掉主干径粗5 cm以下分枝的方式进行修枝试验,分别在第2.5年和4.5年开展生长性状数据调查,通过对其蓄积生长和效益分析比较,评价不同修枝处理间的差异,并选择出效益最优的修枝方式。结果表明,不同修枝处理对林分生长和效益有显著的影响。2.5年生时,大强度修掉1/2高度以下分枝可以使每公顷木材蓄积达到最高,表明修枝能快速促进林木生长,而4.5年生时修枝与不修枝生长差异不显著,以不修枝木材蓄积最高;经济效益分析表明,在4.5年时,修掉1/3树度以下分枝时每公顷蓄积利润率达到1.77,比不修枝提高了4.12%,修枝促进了木材质量和价格明显提升,而该修枝处理可使每公顷木材净收入达45497.72元,经济效益最好,是值得推广种植的定向培育模式。研究结果为大花序桉大径级培育和经济效益提升提供技术和理论依据。

巨桉扩展蛋白EgrEXPA8和EgrEXPA10基因的克隆和表达特性分析

为探讨扩展蛋白在桉树生长发育中的作用,以在桉树初生生长到次生生长转换转录组测序中筛选出的差异表达基因EgrEXPA8和EgrEXPA10为基础,从巨桉(Eucalyptusgrandis)中克隆了2个扩展蛋白基因EgrEXPA8和EgrEXPA10,分别编码249和244个氨基酸,属于亲水蛋白,但Egr EXPA8稳定性高于Egr EXPA10。q RT-PCR分析表明,Egr EXPA8和Egr EXPA10基因均在幼叶和茎尖组织中表达量较高,在木质部和韧皮部表达量较低;且在茎顶端初生生长阶段表达量较高,而在下部次生生长节间表达量较低,可能其主要参与巨桉的初生生长或者负调控次生生长;另外在盐胁迫、茉莉酸甲酯处理下其均被抑制表达;而在水杨酸、缺硼、缺磷处理下均上调表达。这说明EgrEXPA8和EgrEXPA10在巨桉响应逆境胁迫时起到重要作用,且呈现出相似的调控方式。

巨桉EgrWAT1基因克隆和功能初步分析

为探究WALLS ARE THIN(WAT1)在木本植物中木材形成以及响应胁迫中的作用,利用生物信息学工具进行分析,并以巨桉(Eucalyptus grandis)为材料克隆EgrWAT1S及其另一转录本EgrWAT1L,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)探究其在不同组织、节间以及响应胁迫时的表达模式。结果表明:EgrWAT1S在韧皮部表达量较高,而EgrWAT1L主要表达在根部。在茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)处理和盐胁迫以及缺磷、缺硼处理时,其表达存在着明显不同的模式,在MeJA、SA处理时甚至存在着相反的表达模式。这些结果表明EgrWAT1L基因可能通过转录调控来影响EgrWAT1S表达和进一步的蛋白翻译来响应激素和胁迫处理。为进一步研究WAT1基因在巨桉生长发育过程中的作用和调控方式提供基础,也为将来桉树的分子育种提供可能。

尾赤桉叶片及茎段的离体培养与植株再生

以无菌生根苗的叶片和茎段为外植体进行了尾赤桉无性系DH201-2不定芽的诱导及植株再生。通过对外植体的筛选、激素种类和浓度的调整、培养条件的选择,结果表明,取自生根培养基上培养30 d植株的上部和中部的茎段在改良MS+TDZ 0.05 mg.L-1+NAA 0.50 mg.L-1的培养基中获得高达57.0%的丛生芽诱导;取在生根培养基上培养20 d的植株,顶端叶片在改良MS+TDZ 0.05 mg.L-1+IBA 0.10 mg.L-1的培养基中获得48.3%的植株再生;适合于茎段和叶片不定芽分化的Ca(NO3)2浓度为0.706 0 g.L-1。

桉树转基因研究进展

综述了桉树转基因研究中,愈伤组织再生、体胚再生、原生质体再生等的再生体系的建立,农杆菌介导法、基因枪转移法等转基因主要方法以及转化植株筛选及检测的研究进展。探讨了桉树转基因育种发展的限制因素,提出了进行栽培无性系的再生技术、转化技术及转基因育种的完善,多种外源目的基因的转化,加强对外源基因表达的时空调控以及建立转基因桉树安全评价系统的发展建议。

尾赤桉DH201-2遗传转化体系建立的研究

以建立的尾赤桉(Eucalyptus urophylla×E.camaldulensis)DH201-2无性系高频再生体系为基础,利用GUS染色组织分析法研究了根癌农杆菌菌株、农杆菌预培养时间、浸染时间和共培养时间等因素对尾赤桉茎段和叶片外植体遗传转化的影响,探讨了适宜尾赤桉转化的卡那霉素和抑菌抗生素头孢塞污钠的使用浓度。结果表明,较优的转化条件是:采用农杆菌菌株GV3101,以茎段为受体材料,经过预培养6 d,在光密度OD600≈0.5的菌液中浸泡30 min,然后转移到共培养培养基中共培养4 d,再转移到含90 mg/L卡那霉素和300 mg/L头孢噻肟钠的筛选培养基上,进行转化植株的再生,同时在共培养培养基和菌液中添加100μM的乙酰丁香酮能够提高茎段外植体的转化效率。

巨桉AGO基因家族的生物信息学分析

为了解巨桉（Eucalyptus grandis）中Argonaute （AGO）的功能,经全基因组序列分析,巨桉中存在14 个AGO 基因家族成员,基因长度为2676-3225 bp,编码的蛋白质具有保守的Piwi、PAZ、DUF1785 结构域.巨桉EgrAGOs 基因可分为3 组,内含子和外显子结构具有明显的组织特异性.组内成员核苷酸序列和氨基酸序列保守性较高,同源性分别达到88.14% 和82.97%.EgrAGO 基因分布于第2、4、7、8、10、11 条染色体上,在进化过程中存在着串联复制和大片段基因复制机制.预测巨桉的大部分AGO 蛋白定位于细胞核和胞质中,表现出偏碱性和亲水性,具有较高的脂溶指数.基因表达分析表明,桉树EgrAGO成员在不同组织中的表达有明显差异,与木材形成相关的组织/ 器官中有较高的表达.这些为深入研究EgrAGO 基因的功能奠定了基础.

TDZ对尾细桉叶片离体再生的影响

以尾细桉9个无性系叶片为外植体进行叶片离体培养和植株再生研究。结果表明,TDZ对尾细桉的再生诱导起着明显的促进作用,9个尾细桉无性系都获得了植株诱导再生,再生过程中不同的无性系呈现出不同的TDZ响应浓度,TDZ浓度在0.005～0.010 mg/L时获得较高的再生效率。不同无性系之间的再生率呈现出明显的差异,其中无性系YL2获得了最高达69.2%的植株再生效率,且每个外植体平均芽数超过10个。TDZ浓度对YL2的再生起到显著性影响,0.050 mg/L时再生效率最高,可以进行下一步的遗传转化研究。

抗生素与除草剂对尾巨桉离体植株再生的影响

为研究不同抗生素和除草剂对尾巨桉无性系SP7再生体系建立过程中叶片诱导植株再生的影响,在尾巨桉无性系SP7不定芽诱导和生根诱导培养基中添加不同浓度的卡那霉素、潮霉素、草甘膦和草胺膦。结果表明:卡那霉素、潮霉素、草甘膦和草胺膦对桉树无性系SP7叶片不定芽诱导和生根诱导过程中的影响显著。潮霉素、卡那霉素、草甘膦、草胺膦浓度分别为10、40、40、2.5 mg/L时不定芽的产生完全受到抑制;在生根诱导培养基中分别添加8 mg/L潮霉素、50 mg/L卡那霉素、30 mg/L草甘膦、7.5 mg/L草胺膦时,不定芽的生根完全受到抑制。

不同接种和处理方式对巨桉幼苗青枯病发生的影响

桉树青枯病的发生由于影响因素较多导致其人工接种重复性差,因此需要获得稳定的青枯病感染,同时在此基础上可以进行桉树苗期青枯病的防治研究。在本研究中采用水培后伤新根和袋苗未经水培直接伤根后转移到青枯菌液中浸泡6、12、18、24 h后移植,调查桉树幼苗青枯病发病率和生长状况,同时通过在接种前喷施不同浓度的BR、Me JA、SA 3种激素,诱导桉树抵抗青枯菌侵染,调查处理后苗木死亡率。结果表明,未经过水培直接伤根移植的苗木更容易感染青枯菌,经过24 h菌液浸泡处理后的幼苗的死亡率,达到86.67%,同时发现SA对缓解桉树青枯病的发病有明显的作用,且在喷施浓度为0.001 mmol时使用,青枯菌侵染的植株仍有75.0%的存活率。本研究获得了桉树幼苗稳定感染青枯病的一种方式,为室内研究桉树幼苗感染青枯病的机制奠定基础,同时获得了降低桉树青枯病发生的处理方式,为桉树苗期青枯病的防治提供一种方案。

毛竹小RNA高通量测序及病毒分析

以毛竹叶片为材料,采用小RNA高通量测序结合生物信息学对小RNA数据库进行组装,进一步分析了毛竹中存在的病毒和类病毒,并采用RT-PCR和RACE进行验证。结果表明:在竹子样品中存在水稻东格鲁病毒(RTBV),覆盖率达到91.0%。在毛竹样品中扩增得到1 992 bp RTBV病毒类似序列,占其基因组的24.9%。RTBV病毒在多个毛竹样品中存在且不存在多态性。RTBV病毒可能是一个古老的植物病毒,在进化过程中禾本科植物将其序列整合到基因组中来防御RTBV病毒的浸染。

沉香优树嫁接成活率研究

为促进沉香无性繁殖进程,以沉香成年优树萌条为接穗,2年生土沉香实生苗为砧木进行嫁接试验.结果表明：不同优树穗条嫁接成活率呈极显著差异.接穗直径与嫁接成活率密切相关,选择直径在0.6～0.8 cm的接穗,嫁接成活率可达80％以上.接穗和砧木直径差值也影响嫁接成活率,差值在（0±0.09） cm时,嫁接成活率最高为84.9％,而差值大于0.4 cm时,成活率下降到50％以下.砧木接口直径在0.4～1.0 cm时,对嫁接成活率影响不大.

越南奇楠沉香组培苗不定根诱导研究

越南奇楠沉香Aquilaria crassna是瑞香科沉香属植物。试验以越南奇楠沉香的组培苗为材料,研究组织培养中影响不定根诱导的因素。结果表明：培养基中的大量元素、微量元素、NAA的浓度变化、固化剂的种类、活性炭的含量对奇楠沉香组培苗的生根率有显著影响,不同无性系对NAA的反应也表现出显著差异。最适生根培养基为1/4MS大量元素＋1/2MS微量元素＋NAA（0.05-0.2 mg/L）,诱导越南奇楠沉香组培苗生根的最佳NAA的浓度随无性系的不同而不同。

油菜素内酯对巨桉组培中不定根诱导、苗木生长和茎基部细胞结构的影响

以巨桉优良无性系EG5和GL1组培苗为材料,在生根培养基中分别加入0、0.005、0.01、0.05、0.10、0.20 mg·L^(-1)的油菜素内酯,研究其对桉树组培苗中不定根的诱导、茎的生长以及茎基部细胞分化的影响。结果表明:油菜素内酯对巨桉无性系EG5的生根率和苗高具有显著影响,无性系EG5在含有0.005 mg·L^(-1)油菜素内酯的生根培养基中达到最高为76.6%的生根率,同时组培苗的苗高随着油菜素内酯浓度的增加而呈现出逐渐降低的趋势。对于巨桉无性系GL1,在生根培养基中添加0.05 mg·L^(-1)油菜素内酯达到最高为88.3%的生根率,不同浓度的油菜素内酯对苗高没有显著影响。同时也发现油菜素内酯明显抑制了无性系EG5不定根的根长,随着其浓度的增加根长逐渐变短;而根条数表现为低浓度时无显著影响,在高浓度时显著性降低,且油菜素内酯对侧根的诱导和分化不起作用。另外通过对无性系EG5生根植株基部的组织切片和化学染色分析表明,油菜素内酯在0.10 mg·L^(-1)时能促进桉树基部的形成层和木质部的分化,这可能是抑制不定根诱导和分化的原因之一。

缺磷对黑木相思生长、营养和叶绿素荧光的影响

【目的】了解缺磷胁迫后黑木相思主要营养元素的分配与生长及叶绿素荧光的相关性,为黑木相思高效栽培和养分调控提供理论依据。【方法】以黑木相思优良无性系SR17组培苗为材料,在全磷和缺磷Hoagland’s营养液培养3个月,测定黑木相思生长及根、茎和叶器官营养元素含量和叶片叶绿素荧光参数。【结果】1)缺磷培养下,苗木地上生长量受到影响,而根冠比显著提高;2)全株氮(N)、磷(P)、钾(K)营养元素积累显著降低,同时P元素在根、茎和叶中的分配发生明显变化,N/P和K/P比值显著上升,而N和K元素在根、茎和叶中的分配无显著差异,N/K比值保持稳定;3)缺磷胁迫导致叶绿素荧光参数F0、Fm、Fv/Fm和Fv/F0下降,叶片实际光捕获效率(Fv′/Fm′)和光电子效率(ΦPSII)降低,同时光化学反应耗散减小,天线热耗散增大,缺磷胁迫对黑木相思成年叶的叶绿素荧光性能影响大于幼叶;4)叶N、P、K含量与成年叶的叶绿素荧光参数显著相关,根、茎和叶器官的P含量与苗木生长指标相关性强。【结论】黑木相思苗木通过降低P元素在根和茎中的比例,提高在叶中比例,同时保持稳定N/K比来适应缺磷胁迫,植株P元素含量大幅降低是影响成年叶叶绿素荧光性能下降和苗木生长的主要因素。因此针对我国南方缺磷地的黑木相思栽培,施放基肥时应重视磷肥的应用。

缺磷培养下黑木相思苗木的生理生化响应

采用黑木相思组培苗,在缺磷的Hoagland’s营养液下培养3个月,以全磷处理为对照,分析缺磷条件对黑木相思苗木生长、养分含量及其相关生理生化的影响,揭示黑木相思磷胁迫的响应机制。结果表明:缺磷培养后,黑木相思苗木株高、苗杆直径和叶片数量显著下降,但总根长显著增加;叶和根中超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性显著升高,其中叶中过氧化物酶和过氧化氢酶活性升高113.7%和473.3%;缺磷导致叶绿素含量、净光合速率降低,最大净光合速率和表观量子效率显著下降;化学组分分析中,缺磷显著降低了根、茎和叶器官中全氮、全磷和全钾元素含量,根和茎中全磷含量降低了82.9%和86.8%,而各器官的养分利用效率显著提高。通过3个月的缺磷培养,黑木相思苗木虽然生长量受到限制,但尚未出现典型的缺磷病症。