猪增生性肠病间接ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

【目的】研制一种检测胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)抗体的间接ELISA试剂盒,为LI的监测和疫苗评价提供工具。【方法】表达并纯化LI的外膜蛋白Omp2,以其为包被抗原建立检测LI抗体的间接ELISA方法,优化ELISA反应条件;用建立的ELISA方法检测稀释的LI阳性血清来评价试剂盒的敏感性,检测其他病原的阳性血清来评价试剂盒的特异性;试制3批试剂盒,制定试剂盒的敏感性和特异性检验标准,测定试剂盒在4℃的保存期;用试制的试剂盒检测LI阴性和阳性质控血清,研究试剂盒的成立条件;通过对不同时间和猪场采集的1 000份临床猪血清样本的检测来评价该试剂盒的实用性;用本试剂盒与进口商品化试剂盒平行检测LI阳性和阴性血清各50份以评价试剂盒的符合率。【结果】成功表达并纯化了Omp2蛋白,蛋白纯度为90.31%,在Western blot试验中可以与LI阳性血清发生反应。ELISA最佳反应条件为:Omp2以200 ng/孔4℃包被12-16 h;血清1﹕50稀释,37℃孵育30 min;羊抗猪Ig G-HRP 1﹕20 000稀释,37℃孵育30 min;TMB底物37℃显色15 min,用0.5 mol·L^(-1)的硫酸终止反应。该试剂盒检测LI阳性血清的最高检出倍数为8,敏感性较好;试剂盒检测E.coli、App、Mhp、SS2、PRRSV、PRV的结果均为阴性,特异性较好。制定了试剂盒的敏感性和特异性检验标准。试剂盒在4℃可保存15个月。试剂盒的成立条件为:阳性标准血清OD_(450nm)≥1.25,阴性标准血清OD_(450nm)<0.3。试制的试剂盒批内、批间重复性试验变异系数均小于10%。与国外商品化ELISA检测试剂盒对比的符合率达86%。用试制的ELISA试剂盒检测1 000份华东部分地区临床猪血清样品,其中LI阳性检出率为59.90%,表明LI在华东地区猪群中普遍存在。【结论】本研究开发的LI间接ELISA抗体检测试剂盒特异性高,灵敏度高,与商品试剂盒符合率高,可用于临床LI抗体的检测。

我国中东部主要养猪地区死亡育肥猪呼吸道病原菌的流行病学调查及猪多杀性巴氏杆菌的特性鉴定

【目的】从我国中东部主要养猪地区因呼吸道疾病死亡的育肥猪病料中分离主要病原菌,并进行鉴定和分型,为近年流行的猪呼吸道病原菌的防控治疗提供流行病学依据。此外,对分离的猪多杀性巴氏杆菌(Pm)特性进行鉴定,为Pm疫苗研制提供参考。【方法】收集2021-2023年我国中东部主要养猪地区规模化猪场因呼吸道疾病死亡的育肥猪的病猪肺脏;用血琼脂和TSA培养基分离病原菌,通过微生物学和分子生物学方法鉴定分离菌株;合成adk、est、gdh、mdh、pgi、pmi和zwf基因引物,以分离的Pm为模板进行PCR,通过测序7对管家基因对Pm进行MLST分型;通过PCR对Pm进行荚膜分型和脂多糖分型;通过PCR对Pm的毒力因子进行检测;在ICR小鼠对单一分离的A型和部分D、F型Pm进行毒力鉴定;检测JS-65、JS-51和JS-34在ICR小鼠的LD_(50)。【结果】共分离Pm 73株,分离率为15.53%;分离猪链球菌(SS)71株、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)29株和副猪格拉菌(GPS)10株,分离率分别为15.11%、6.17%和2.13%。分型结果表明,Pm主要为A:L3型,占55%;SS主要为9型,占38.03%;APP主要为15型,占51.72%;GPS主要为5/12型,占60%。混合感染包括Pm+SS,Pm+APP,SS+APP和Pm+APP+GPS,混合感染占总猪群的16.67%。共分离到3种Pm荚膜型:A(67%)、D(30%)和F(3%)型;2种脂多糖型:L3型(56%)和L6型(44%);9种ST分型:ST79、ST50、ST7、ST74、ST13、ST27、ST9、ST287和ST370,所占比例分别为33%、26%、16%、10%、4%、4%、3%、3%和1%。毒力基因检测结果表明:ptfA、fimA、hsf-2、exbB、exbD、tonB、fur、nanH、sodA和sodC的阳性率大于95%;hsf-1、pfhA、tadD、hgbA、hgbB、pmHAS、ompA、ompH、oma87和plpB阳性率在40%-90%之间;tbpA和nanB阳性率在10%-30%;未检出toxA。毒力鉴定结果表明A型菌株在剂量小于10^(2)CFU时导致小鼠全部死亡,D型菌株在10^(3)CFU剂量时小鼠死亡率为60%-100%,F型菌株在5×10^(3)CFU剂量时小鼠死亡率为60%。在ICR小鼠检测JS-65、JS-51和JS-34的LD_(50),结果表明JS-65 LD_(50)<10 CFU,JS-51 LD_(50)=6.3×10^(2)CFU,JS-34 LD_(50)=3.98×10^(3)CFU。【结论】2021-2023年我国中东部主要养猪地区病原菌分离结果表明,Pm、SS、APP和GPS是死亡育肥猪的主要呼吸道病原菌,Pm在肺脏中的分离率最高。采用RIRDC分型鉴定到一株ST370 Pm,拓展了猪Pm的MLST分型数据。Pm优势基因型为A:L3:ST79,其在ICR小鼠中毒力最强,最小致死量小于10 CFU,为后续Pm灭活疫苗研制奠定基础。

细胞糖酵解对猪流行性腹泻病毒复制的影响

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染细胞后,细胞糖酵解的变化及其对PEDV复制的影响,本试验通过实时荧光定量PCR和Western blot检测PEDV感染猪小肠上皮细胞IPEC-J2后36 h糖酵解相关酶己糖激酶2(HK2)的表达水平,然后通过添加糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)来进一步验证细胞糖酵解对PEDV复制的影响,最后检测了正常浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)和高浓度葡萄糖(11.1 mmol/L和22.2 mmol/L)培养条件下PEDV复制情况来探究葡萄糖浓度对PEDV复制的影响。结果表明,PEDV感染显著增加糖酵解限速酶HK2的表达,PEDV感染可增强IPEC-J2细胞的糖酵解,细胞糖酵解水平增强有利于PEDV的复制。在一定范围内提高葡萄糖浓度可促进PEDV复制。研究结果为初步阐明PEDV感染机制以及冠状病毒病的综合防控提供了理论依据。

雷氏普罗威登菌引致中华鳖脏器脓肿

江苏省某养殖场饲养的中华鳖发生败血症 ,特征为肺脏、脾脏等内脏广泛形成干酪样结节。从病鳖内脏分离到一种革兰氏阴性杆菌 ,兼性厌氧 ,丙氨酸脱羧酶阳性 ,利用柠檬酸盐、吲哚和甲基红反应均为阳性 ,发酵甘露醇、肌醇、甘露糖 ,产酸。经鉴定为雷氏普罗威登菌 (Providenciarettgeri)。药敏试验表明 ,该菌对羧苄青霉素、先锋霉素、SMZ +TMP、氟哌酸、恩诺沙星敏感。以分离菌腹腔注射感染健康中华鳖 ,接种鳖 1周后陆续发病死亡 ,并从其体内分离到同种细菌。

马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验

将含猪链球菌 2型mrp及马链球菌兽疫亚种类M基因融合片段的重组质粒转化大肠杆菌BL 2 1,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,表达了相对分子质量为 6 0 0 0 0左右的融合蛋白。利用组氨酸亲和层析柱 ,获得了纯化的融合蛋白 ,质量浓度为 4 2 μg·mL-1。以纯化的融合蛋白、宿主菌BL 2 1经IPTG诱导表达后的超声波破碎上清、马链球菌兽疫亚种ATCC 35 2 4 6株和猪链球菌 2型HA 980 1株制备的二联灭活苗为免疫原 ,分别免疫 30头仔猪。初次免疫 1月后 ,以同样的剂量再次免疫 ,3周后以 5×LD50 的ATCC 35 2 4 6和HA 980 1强毒株进行攻击。结果 ,纯化融合蛋白免疫组的免疫保护率达 6 0 % ,BL 2 1上清免疫组的免疫保护率为 5 0 % ,全菌二联灭活菌苗的免疫保护率达 90 %。

马链球菌兽疫亚种类M蛋白的基因克隆、序列分析及其在猪源链球菌的检测

根据已发表的马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp .zooepidemicus)马源株的类M蛋白基因序列 ,设计和合成一对引物 ,以兽疫亚种猪源ATCC35 2 4 6株的基因组DNA为模板 ,通过PCR技术 ,扩增出类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET_32a(+)中 ,测定其序列 ,GenBank接收号为AY2 6 3781。类M蛋白基因含一个完整的开放阅读框 ,全长为 1137bp ,编码 379个氨基酸残基。经DNAStar软件分析 ,ATCC35 2 4 6株类M蛋白基因与兽疫亚种马源W6 0株、马亚种的类M蛋白基因及A群化脓链球菌的M蛋白基因的同源性分别为 86 9%、30 8%、2 9 4 % ;推导的氨基酸序列的同源性分别为 84 3%、2 1 9%、2 3 4 %。但ATCC35 2 4 6株类M蛋白的C末端细胞膜锚定区与M蛋白、马亚种类M蛋白高度同源。用上述设计的引物进行PCR试验 ,检测 34株猪源链球菌类M蛋白基因 ,发现所有 16株C群猪源链球菌均能检测出类M蛋白基因 ,而所有猪链球菌 (Streptococcussuis) 1型和 2型菌株及S群、B群、D群链球菌共 13株均不能检出类M蛋白基因 ,而 5株未鉴定的猪源链球菌中 3株能检测出类M基因。

猪链球菌2型mrp基因免疫功能片段的克隆、表达及动物试验

根据猪链球菌 2型 (Streptococcussuistype 2 )国外分离株的溶菌酶释放蛋白 (Muramidase releasedprotein ,MRP)的基因序列 ,设计并合成一对引物 ,利用PCR技术扩增了江苏分离株的开放阅读框 2 98～ 82 7bp间 5 2 9bp的基因片段 ,并定向克隆至pET 32a(+)表达载体中。重组质粒经限制性酶切鉴定和测序 ,转化至大肠杆菌BL2 1 ,经IPTG诱导 ,可表达分子量约 4 2kD的蛋白。经过镍亲和层析柱层析 ,获得纯化的重组蛋白。以重组蛋白免疫Balb c小鼠 ,以 5LD50 猪链球菌强毒株攻击后小鼠的相对存活率达 6 2 5 %。

猪源马链球菌兽疫亚种灭活疫苗对小鼠的免疫效力评价

【目的】评价中国不同地区猪源马链球菌兽疫亚种分离株抗原性的差异,为猪链球菌病疫苗的研制提供指导。【方法】取从国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种分离株,分别制备灭活疫苗,免疫12周龄ICR小鼠,用同源菌株和ATCC35246株攻击。【结果】以同源菌株攻击免疫小鼠,除CG-74-63株外,其余菌株的保护率均在90%以上;而以异源菌株ATCC35246进行攻击,免疫小鼠的免疫保护率为80%～100%。【结论】中国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有保护性。

猪源马链球菌兽疫亚种中国分离株类M基因特性分析

目的阐明国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因的特性,为疫苗研制提供指导。方法利用PCR技术,扩增国内9省市从1974～2003年分离的9株马链球菌兽疫亚种类M基因,并进行克隆、测序及序列分析。结果发现7株类M基因长度为1137bp,含一个阅读框,CG-74-63和CP-0104株的长度分别为1143bp及1125bp。除1株关节炎分离株CP-0104外,引致败血症的8株菌类M基因的核苷酸同源性高达95.4%～99.9%,推导的相应氨基酸序列同源性高达92.1%～100%。9株猪源菌与马源菌株及人源菌株类M基因的核苷酸同源性分别为81.6%～87.0%、81.7%～91.8%。9株猪源分离株类M蛋白信号肽、C末端细胞锚定区的序列均高度同源;除CP-0104外,其余8株高变区高度同源。结论国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因同源性高。

全日制兽医专业学位研究生培养的实践与探索

从兽医专业学位研究生教育综合试点改革思路着手,围绕改革举措及成效,介绍了南京农业大学2010年以来在兽医专业学位研究生课程体系建设、师资队伍及实践基地建设、管理体制改革等方面取得的成绩和经验,并就今后的改革工作提出了展望。

用发酵罐制备嗜水气单胞菌疫苗用菌液培养条件的优化

本试验探讨了用发酵罐培养嗜水气单胞菌灭活疫苗生产菌株Ｊ－１株菌液的最佳条件。分别以发酵罐和摇床在不同的培养条件下培养Ｊ－１株制备菌液，前者１２个批次，后者６个批次。比较不同的培养条件对细菌菌体数量及ＨＥＣ毒素产量的影响。结果表明：发酵罐培养优于摇床培养，以产毒素培养基于２８℃发酵罐通气培养Ｊ－１株，培养２８小时效果最佳，培养菌液含菌量达２．９×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ，培养液上清的溶血价达２７，发酵液中残糖为０．１２ｇ／Ｌ，符合发酵工艺要求。

嗜水气单胞菌疫苗的检验及免疫效力试验

选用嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ，Ａｈ）疫苗生产用菌Ｊ－１株，以气升式发酵罐２８℃通气培养２８ｈ，制备嗜水气单胞菌疫苗用菌液。半成品检验表明，该疫苗用菌液内无杂菌生长，细菌数量达２．７×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ。以０．４％福尔马林溶液３７℃灭活２４ｈ，制成灭活疫苗。经成品检验，该疫苗为棕黄色液体，涂布平板无活菌生长，以１×１０７ｃｆｕ攻击６尾健康鲫鱼，１周内鲫鱼无异常反应。取该疫苗分别以腹腔注射和浸泡两种方式各免疫１２尾鲫鱼，１月后以同源强毒菌株攻击，疫苗的相对存活率分别为８３．３％和５８．３％。

嗜水气单胞菌J-1株培养特性和免疫原性的研究

将嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ，Ａｈ）Ｊ－１菌株第５代［Ｊ－１（５）］在产毒素培养基上连续传代至第３５代［Ｊ－１（３５）］，并分别检测Ｊ－１（６）和Ｊ－１（３５）的生化特性。另取Ｊ－１（６）、Ｊ－１（１５）、Ｊ－１（２５）和Ｊ－１（３５）分别制备嗜水气单胞菌灭活疫苗，用其分别免疫鲫鱼，之后用Ａｈ强毒攻击；同时用Ｊ－１（６）经腹腔注射或浸泡各免疫组鲫鱼，测其最低免疫剂量。结果显示，从第５代传至３５代，Ａｈ菌株的培养特性和免疫原性没有显著差异；腹腔免疫和浸泡免疫的最低有效剂量分别为１×１０７ｃｆｕ／尾和５×１０７ｃｆｕ／ｍＬ。表明ＡｈＪ－１株可作为理想的疫苗生产株。

老山蜂王浆冻干粉免疫调节作用的研究

以Balb/c小鼠为实验动物模型,通过二硝基氟苯诱导小鼠迟发性变态反应,再以不同浓度的老山蜂王浆冻干粉灌服,分别检测蜂王浆冻干粉对小鼠细胞免疫功能的影响;同时通过小鼠碳廓清试验,检测蜂王浆冻干粉对小鼠巨噬细胞功能的影响。结果显示,蜂王浆冻干粉能增强小鼠的迟发性变态反应,高剂量试验组比对照组小鼠耳廓肿胀度超过3 mm;蜂王浆冻干粉中高剂量组小鼠的巨噬细胞吞噬指数显著高于对照组,试验组NK细胞的活性达到36.1%,显著高于对照组,表明蜂王浆冻干粉能增强NK细胞的杀伤能力。蜂王浆冻干粉对小鼠具有免疫调节作用。

高度特异的李斯特菌单抗试剂的研制及鉴定

以单核细胞增生李斯特菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，ＬＭ）制备免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术，建立了３株能稳定分泌抗单核细胞增生李斯特菌、无害李斯特菌和格氏李斯特菌的单克隆抗体的细胞系，分别是ＬＪ１０Ａ，ＬＭ１１和ＬＢ５，而与其余种的李斯特菌和属外细菌不发生交叉反应。３株单抗均为ＩｇＭ。

抗李斯特菌特异单抗试剂的研制及应用

用１％福尔马林灭活单核细胞增生李斯特菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）Ｇ１９５１３０ｍｉｎ制成免疫原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，获得３株高度特异的针对单核细胞增生李斯特菌、无害李斯特菌和格氏李斯特菌的单克隆抗体，分别命名为ＬＪ１０Ａ、ＬＢ５、ＬＭ１１。选择其中１株ＬＪ１０Ａ作为包被抗体和酶标抗体，建立了快速、敏感、特异的检测该菌的单抗夹心ＥＬＩＳＡ方法。该方法对单核细胞增生李斯特菌的最小检出量为５×１０５，模拟样品能检出５００ｃｆｕ／ｋｇ样品，且４０ｈ内能报告结果。通过检测２４０份肉样和８５０份奶样并与常规方法平行相比较，该方法的敏感性和特异性分别达到１００％和９６．９％。

嗜水气单胞菌菌种的限定代次及保存条件研究

将嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila ,Ah)J 1菌株第 5代菌种通过鲫鱼体内复壮后 ,制备基础种子。将基础种子在普通营养琼脂培养基上连续传至 10代 ,分别测第 1代和第 10代的培养特性、免疫原性以及其毒力 ;同时 ,对Ah菌种的保存条件进行了优化。结果嗜水气单胞菌菌种在 1～ 10代之内 ,其培养特性、免疫原性以及毒力完全相同 ,表明嗜水气单胞菌基础种子的使用限定代次至少可达 10代。Ah菌种以 15 %甘油肉汤、 - 2 0℃保存为佳 ,保存期可达两年。

快速、特异检测李斯特菌单抗-夹心ELISA方法的建立及应用

本研究以高度特异的、针对单核细胞增生李斯特氏菌、无害李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌共同表位的单抗ＬＪ１０Ａ为捕捉抗原抗体和酶标抗体，建立了快速检测该菌的单抗夹心ＥＬＩＳＡ方法。该方法对单核细胞增生李斯特菌的最小检出量为５×１０５个菌／ｍｌ。人工模拟样品至少可检出５个菌／１０ｇ样品，并在４８小时内报告结果。在实际应用中，我们以该法检测了２４０份肉样和８５０份奶样，并平行以改良ＭｃＢｒｉｄｅ琼脂分离细菌相比较，证实该方法的敏感性和特异性分别达到１００％和９６．９％。