鸡白痢沙门氏菌病原的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定新疆某些地区鸡白痢沙门氏菌主要流行株的流行现状和耐药情况,本研究采用平板凝集试验方法对有发病史的种鸡场进行现场检测,被检的750只鸡中,发现78例疑似鸡白痢沙门氏菌感染,运用沙门氏菌鉴别培养基、组织病理学观察和PCR方法进行确诊,并进行药敏试验。结果显示,疑似的78例鸡白痢沙门氏菌中有69例符合鸡白痢沙门氏菌的生化特性和病理学特点,PCR成功扩增出invA基因,分离率为9.2%,血清型诊断为D1型;其中分离菌对万古霉素和新霉素耐药性最高,耐药率分别为100.0%和81.2%,而对头孢曲松、克拉维酸和多黏菌素的敏感率达60.0%以上。本研究为养殖户和兽医工作者在净化鸡白痢沙门氏菌及临床用药方面提供参考。

沙门菌LAMP可视化检测方法的建立与应用

建立沙门菌病原体的一种可目视化环介导等温扩增技术(LAMP),实现对沙门菌的高效快捷检测。针对沙门菌的invA基因的高度保守区域,设计一套特异性引物,优化LAMP扩增反应体系和条件,并对该方法的特异性、灵敏性和人工污染样品以及临床样品分别进行检测。与传统的细菌分离与鉴定、PCR和real-time PCR方法进行敏感性比较。该方法优化后的最佳反应体系为内外引物浓度比例为3∶1,dNTPs为2.5μL,MgSO_4为1.5μL,2.5μL甜菜碱(10mol/L),1μL Bst 2.0DNA聚合酶,在62℃恒温条件下反应50min,可以特异性检出沙门菌,而对其他非沙门菌病原的检测结果为阴性。该方法的最低检测线为1.0×10~2 CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的1 000倍,与real-time PCR方法的灵敏度基本接近;针对人工污染沙门菌的鱼粉其检测灵敏度为5.0×10~2 CFU/mL;对临床样品的检出率为65.4%,与传统检测方法的检出率一致。本研究建立的LAMP检测沙门菌的方法特异性强、灵敏度高、操作简便、效能高和可视化,为基层监管部门和畜牧兽医工作者对于沙门菌病原的监控和初步筛选提供了技术保障。

鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。

鸡白痢沙门氏菌胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制及初步应用

为了建立一种适合基层现场的鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)抗体检测方法,以S.pullorum的基因组为模板,利用PCR方法扩增inv A基因并进行原核表达后,用Ni-NTA纯化inv A融合蛋白,Western-blot和ELISA进行分析;采用30 nm的胶体金溶液标记山羊抗鸡Ig Y,并对金标抗体的质量浓度和p H值进行优化;在NC膜上分别包被inv A融合蛋白和鸡Ig Y作为检测线和质控线,评估其特异性、灵敏性和稳定性.用该方法对临床的195份血清进行检测,平板凝集试验验证其准确性.结果表明:构建的inv A重组蛋白质粒在大肠杆菌BL21中成功高效表达,获得的蛋白纯度较高,经Western-blot和ELISA方法证实具有良好的反应原性.该试纸条最佳胶体金标记的p H值为7.6,抗体质量浓度为1.3 mg/m L,方法的灵敏性与平板凝集试验的灵敏性一致,与其他病原菌无交叉反应.对195份临床样本进行检测,其结果与平板凝集试验的符合率为96.43%.研究建立的S.pullorum胶体金免疫层析检测试纸条具有方便、快捷、安全和灵敏度高等优势,可用于S.pullorum抗体的早期检测和流行病学筛查.

布鲁菌感染细胞NF-κB的表达水平检测及其干扰方法研究

目的本文针对布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中NF-κB的表达进行检测,并比较siRNA和shRNA对RAW264.7细胞中NF-κB表达沉默效果。方法根据NF-κB P65基因序列,设计siRNA干扰序列,通过干扰RAW264.7细胞筛选效率较高的siRNA设计shRNA序列,siRNA和shRNA同时干扰布鲁氏菌侵染的RAW264.7细胞,使用RT-PCR方法检测NF-κB P65基因的相对表达情况。结果与阴性对照mock组相比,P65-shRNA组表达降低;P65-siRNA组P65表达低于P65-shRNA组,均低于阴性对照mock组;布鲁氏菌侵染组,P65表达显著高于阴性对照组。结论布鲁氏菌侵染组促进了NF-κB P65的表达,P65-shRNA、P65-siRNA组均抑制了NF-κB P65的表达,siRNA可作为基因沉默中快速筛选的工具,在RNA干扰的应用中可与shRNA配合使用。

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达及功能分析

为构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达载体,并进行表达、鉴定。从羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M株的基因组中克隆BMEI0742基因片段,亚克隆到pMD19-T载体中并测序,克隆至表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-BMEI0742利用大肠杆菌进行表达,并进行Western-Blot检测,对该蛋白功能进行生物信息学分析。成功构建了pET-28a-BMEI0742原核表达载体,SDS-PAGE检测结果显示,重组蛋白的分子量约是50 ku,BMEI0742蛋白可与布鲁氏菌阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构以α-螺旋为主并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。本研究成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因,并成功获得了BMEI0742蛋白,该蛋白具有与布鲁氏菌自身蛋白相同的抗原性,为布鲁氏菌翻译延伸因子Tu,为进一步研究其免疫性和保护性以及在布鲁氏菌的致病机制奠定基础。

布鲁氏菌不同菌株间差异蛋白的研究进展

布鲁氏菌病是一种全球流行性的人兽共患病,严重威胁着人类的健康及畜牧业的发展。随着蛋白质组学研究技术的快速发展,通过不同布鲁氏菌菌株间蛋白质组学研究,分析羊种布鲁氏菌强毒株与疫苗株间的差异蛋白,牛种布鲁氏菌与羊种布鲁氏菌间的差异蛋白,猪种布鲁氏菌强毒株与疫苗株间的差异蛋白,可为探求布鲁氏菌在致病机制、毒力因子、代谢通路、诊断标志物以及新型疫苗的研制等热点研究方面提供理论依据和解决方法。通过对布鲁氏菌的蛋白质组学研究,以期在布鲁氏菌病诊断防治研究上取得重大突破。

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白基因VceA的原核表达、纯化及功能分析

本研究对布鲁氏菌分泌蛋白VceA基因进行了原核表达与纯化,并分析其反应原性,致炎特性和分子特性。应用PCR技术从布鲁氏菌2308基因组中扩增VceA基因,亚克隆至PMD19-T载体后,进行测序,构建重组表达质粒PGEX-4T-1-VceA,然后转化至E.coli BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,Western Blot检测其反应原性;用重组蛋白作用于细胞,检测炎症相关细胞因子的分泌量;并对该蛋白进行生物信息学分析。结果显示:PCR扩增出VceA基因,SDS-PAGE显示纯化的VceA融合蛋白大约在37 kD处,Western Blot也出现了杂交带。细胞实验表明重组蛋白刺激细胞后产生的IL-18,IL-1β,TGF-β1的含量均显著高于BSA对照组(P<0.05)。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,存在信号肽,属于分泌型蛋白,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,并利用Phyre2软件成功构建了该蛋白的三维模型。结果表明,成功克隆并表达了布鲁氏菌Vce A蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,并具有致炎作用。这为进一步研究布鲁氏菌分泌蛋白的致病机制奠定了基础。

牛种布鲁氏菌2308参考株Δ VceC基因缺失株的构建与鉴定

为了研究布鲁氏菌四型分泌系统VceC蛋白的功能,构建牛种布鲁氏菌2308参考株△vceC的基因突变株,本研究以牛种布鲁氏菌参考株2308的分泌蛋白VceC为研究对象,以牛种布鲁氏菌参考株基因组为模板,高保真(pfu酶)扩增VceC基因的上下游同源臂基因;以卡那抗性基因质粒为模板高保真扩增卡那抗性基因,运用融合PCR将上下游同源臂和卡那抗性基因融合,用TA克隆的方法将融合片段连接到克隆载体上,再用电转化的方法将载体转入布鲁氏菌2308感受态细胞中,最后用卡那抗性筛选并检测其遗传稳定性。将亲本株2308缺失株2308△VceC在相同起始浓度下震荡培养,观察其生长变化趋势;侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8),比较其在胞内的生存能力。结果显示:利用T载体克隆和抗性替换的方法成功构建了2308的VceC的突变株,与亲本株相比,2308△VceC在体外培养生长趋势与亲本株相似,在12 h时进入对数生长期,30 h时进入平台期,胞内CFU显示侵染12 h后缺失株胞内细菌数量明显下降,亲本株2308和2308-Δ VceC缺失突变株在12 h时差异显著。本研究为布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统的功能研究奠定了基础。

布鲁氏菌分泌蛋白BspJ亚细胞定位分析

[目的]对布鲁氏菌分泌蛋白BspJ进行亚细胞定位分析,为深入探索该分泌蛋白的功能奠定基础。[方法]使用生物信息学方法对分泌蛋白BspJ的核酸和氨基酸序列进行生物信息学分析;利用常规PCR方法扩增BspJ目的基因并克隆到pMD19-T载体;构建真核表达载体pDsRed2-C1-BspJ并转染HEK293T细胞,制作细胞爬片后进行激光共聚焦显微镜分析;利用RT-PCR方法分析HEK293T转染细胞中BspJ转录情况。[结果]生物信息学分析结果显示,BspJ基因ORF全长是531bp,共编码177个氨基酸,BspJ蛋白无跨膜结构,有7个抗原决定簇,具有核定位信号(NLS)和核输出信号(NES),据此推测BspJ蛋白亚细胞定位可能具有核—胞浆穿梭过程;PCR方法扩增出BspJ基因;成功构建pDsRed2-C1-BspJ重组质粒;激光共聚焦分析显示BspJ蛋白定位于宿主细胞核及核周围;RT-PCR分析显示BspJ基因于宿主细胞中进行转录。[结论]布鲁氏菌分泌蛋白BspJ分布于宿主细胞核及核周围,可能具有胞核—胞质穿梭过程。