江苏省23例猴痘病例病毒基因组特征分析

目的分析2023年6月至9月江苏省23例猴痘病例病毒全基因组序列并研究其分子进化特征。方法收集猴痘病例口咽拭子、痘疱液、痘疱渗出物拭子等样本,以实时定量PCR进行病毒核酸检测,利用扩增子测序技术捕获猴痘样本中病毒全基因组,通过MiniSeq高通量测序仪进行二代测序,对序列进行病毒进化和变异分析。结果23份样本的平均测序深度907.30×~11578.58×,基因组覆盖度(测序深度≥10×)95.50%~99.94%。系统发育分析显示,病毒均属于MPXVⅡb C.1(2023)谱系,与来自同时期日本、韩国、葡萄牙和中国的序列同属一个分支,并分布于3个聚类簇中。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNPs)分析共发现60个SNPs,包含59处碱基替换和1处碱基缺失,其中非同义突变26个,分别影响宿主免疫调控、膜蛋白和病毒转录调控功能。26个非同义突变中有25个SNPs为载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样(APOBEC3-like)突变,且23份样本中的6个共享突变均为APOBEC3-like突变。样本23010与23011只有C177833T一个突变位点的区别,且C76450T和G80405A位点均只在这两个样本中出现。结论江苏省2023年6月至9月23例猴痘病毒均为Ⅱb进化分支C.1(2023)谱系,病毒来源为多个源头输入,应持续开展猴痘病毒全基因组监测和研究,密切关注病毒来源和在本地传播后的变异进化方式。

应用蛋白组学方法筛选和鉴定乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白

前S1蛋白(PreS1)在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用.为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合蛋白,利用此蛋白与HepG2细胞裂解液进行Pull-down实验,其产物进行双向凝胶电泳分离.结果发现2个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和葡萄糖调节蛋白75(GRP75).通过免疫共沉淀和Western印迹分析证实,PreS1与GRP75之间存在相互作用.实验结果表明,GRP75为新发现乙型肝炎病毒PreS1特异结合蛋白,其与PreS1结合后的生理功能以及在HBV感染过程中的作用值得深入研究.

感染弓形虫小鼠脾脏CD4^+CD25^+T细胞的变化

目的观察小鼠感染刚地弓形虫后脾脏CD4+CD25+调节性T细胞的动态变化。方法将28只雌性C57BL/6小鼠随机分为4组,其中3组每鼠腹腔接种弓形虫速殖子悬液200μl(含弓形虫速殖子5×104个/ml),对照组腹腔接种灭菌PBS200μl。分别于弓形虫感染后第2、4和6天取脾,制成单个核细胞,用实时荧光定量PCR检测脾CD4+T细胞Foxp3基因表达水平,流式细胞仪检测脾CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例,并对CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+T细胞进行绝对计数。结果感染后第4和6天,小鼠脾脏CD4+T细胞Foxp3mRNA相对表达水平分别为1.89±0.23和1.79±0.24,均显著高于正常水平(1.00±0.12)(P<0.01);CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例从感染后第2天(15.07%±2.73%)开始上调(P<0.05),至感染后第4和6天分别为24.29%±3.19%和19.80%±2.66%,均明显高于正常水平(11.58%±2.04%)(P<0.01);脾脏CD4+T细胞占脾细胞的比例及其绝对数量均从感染后第2天开始降低,至感染后第6天分别降至5.49%±1.71%和(1.71±0.44)×106(P<0.01)。结论弓形虫感染导致小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+T细胞的比例上调,而脾脏CD4+T细胞的显著减少是促成比例上调的主要原因。

基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P>0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。

弓形虫培养上清体外对CD4^+CD25^+T细胞的影响

目的探讨体外培养条件下弓形虫培养上清对CD4+CD25+T细胞的影响。方法用弓形虫培养上清和自小鼠脾脏分离的CD4+CD25+T细胞共同孵育,Annexin-v染色法检测CD4+CD25+T细胞的凋亡情况,淋巴细胞增殖实验检测CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞的抑制功能。结果用弓形虫培养上清孵育10h的小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞有(36.90±0.36)%出现凋亡,和RPMI-1640孵育组相比,凋亡率上升了(13.60±2.15)%。与RPMI-1640孵育组相比,用弓形虫培养上清处理5、10h的小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞的抑制功能下降(P<0.01)。结论弓形虫培养上清中可能存在某些成分能够诱导CD4+CD25+T细胞出现凋亡,并使CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞的抑制功能下降。

2008-2009年江苏省肠道病毒71型分子流行病学研究

目的探讨2008-2009年江苏省肠道病毒71型（EV71）分离株的病毒基因特征。方法选取18份EV71分离株,用一对特异引物进行VP1全基因核苷酸序列扩增,在ABI3130型自动测序仪上测序,序列结果用DNA Star和MEGA4软件进行分析,并与各型参考株进行比较。结果 18株病毒与安徽省阜阳市和山东省临沂市分离的C4a基因型参考株最为相近,核苷酸同源性在96.3%~99.6%之间,氨基酸同源性在99.0%~99.7%之间;而与A、B基因型参考株比较差异较大,核苷酸同源性只在81.8%~84.4%之间,氨基酸同源性在94.3%~97.0%之间;说明本文的18株病毒均属于EV71型C4a基因型。结论 2008-2009年江苏省分离的18株EV71可能与安徽省和山东省分离的EV71有相同的起源,均属于C4a亚型;目前C4a亚型病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播。

高通量测序H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法的优化及应用

目的:建立一种较优的高通量测序H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法,用于H7N9禽流感病毒基因组监测。方法:分别以6碱基随机引物反转录生成单链cDNA,合成双链cDNA;流感病毒通用反转录引物U12反转录生成单链cDNA,6碱基随机引物合成双链cDNA;U12引物反转录生成单链cDNA,通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备高通量测序模板、构建测序文库、测序并分析数据,比较3种方法对高通量测序效率的影响,并与传统Sanger测序方法比较其测序的准确性,选择其中较优的方法用于高通量测序。结果:以U12引物反转录cDNA,通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备的高通量测序模板,在测序族生成数、覆盖率、单核苷酸多态性及读长等方面均优于另外两种方法。结论:本研究建立的H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法用于高通量测序具有准确性高,周期短,成本相对较低,可同时检测多个样本等特点,可用于大规模H7N9禽流感病毒基因组监测。

液相芯片技术在诊断江苏省首例人禽流感病例中的应用

[目的]对2007年12月江苏省发生的一例不明原因肺炎病例进行液相芯片检测,探讨该技术在不明原因肺炎诊断中的作用。[方法]采集病例的呼吸道标本,利用液相芯片方法对呼吸道重要致病体进行核酸检测。[结果]呼吸道标本甲型流感病毒,H5及N1亚型禽流感病毒特异性核酸均为阳性。[结论]应用液相芯片技术,可快速确定该不明原因肺炎病例为高致病性禽流感(H5N1)感染,为及时防控和治疗提供依据。

含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒样颗粒的制备及应用

目的构建耐RNase酶的内含禽流感病毒H5N1亚型部分核酸序列的病毒样颗粒。方法构建中间载体pET32a-MS2,将禽流感病毒H5N1亚型的HA、NA和M基因片断连接到中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA和pET32a-MS2-M,分别转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒。结果表达载体经PCR、酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。电镜观察到了病毒样颗粒,荧光定量RT-PCR试验表明颗粒稳定性良好。结论成功构建了含禽流感病毒H5N1部分核酸序列的病毒样颗粒且稳定性良好,可作为禽流感H5N1亚型RNA检测的标准品和质控品。

重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。

环介导等温扩增结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术快速检测脑膜炎奈瑟菌

目的 建立一种适合现场使用、灵敏、特异的脑膜炎奈瑟菌（N.men）检测方法。 方法 针对N.men的ctrA基因设计环介导等温扩增（LAMP）特异性引物和核酸侵入反应探针，对LAMP扩增产物进行核酸级联侵入反应和纳米金颗粒探针杂交检测。优化反应体系和反应条件后进行敏感性和特异性实验，并与Real-Time PCR检测方法进行比较。 结果 以核酸级联侵入反应和纳米金颗粒探针显色技术检测LAMP扩增产物和毛细管电泳法具有相同的敏感性和特异性；LAMP结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术的检测敏感性为10 copies DNA分子/反应，且与其他病原体之间无交叉反应。在临床样本检测方面，LAMP结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术与Real-Time PCR检测效果相当。 结论 结合LAMP、核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术建立的N.men检测方法灵敏、特异，无需特殊仪器，适用于基层检测和现场快速检测。

羊及其体表蜱中SFTSV的分离培养与全基因序列分析

目的 调查2012年春季江苏省某县羊及其体表蜱中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）感染情况,并对分离到的毒株进行全基因序列分析.方法 采用荧光定量RT-PCR法对标本进行SFTSV核酸检测,所有阳性标本进行病毒分离并测序,序列结果用Lasergene和MEGA4软件进行拼接和分析.结果 7只羊和从羊体上采集的93只长角血蜱中,1只羊的血清和淋巴结SFTSV核酸检测呈阳性,附着于该羊体表的1只长角血蜱病毒核酸也呈阳性,通过病毒分离获得2株SFTSV毒株,JS2012-yang01（羊）和JS2012-pi01（蜱）.序列分析结果显示,JS2012-yang01和JS2012-pi01的L、M和S基因片段的核苷酸同源性分别为99.8％ 、99.8％ 、100.0％,氨基酸同源性分别为99.6％ 、99.6％、100.0％,进化树分析显示两株病毒处于同一亚分支.2株毒株与中国其他地区流行的SFTSV毒株核苷酸序列同源性介于95.9％～～ 99.6％（L基因）,94.7％～～99.5％（M基因）和95.0％～99.5％（S基因）,与布尼亚病毒科白蛉病毒属其他毒株序列差异较大.结论 该调查中分离自羊和蜱的SFTSV高度同源.蜱虫通过叮咬吸血,可能在SFTSV从动物到人的传播过程中起媒介作用.

手足口病病原液相芯片检测方法的建立

目的:建立检测手足口病病原的液相芯片方法。方法:设计、合成并修饰基因特异性引物和寡核苷酸探针,将寡核苷酸探针和荧光编码微球进行偶联,制备液相芯片;将样本核酸多重PCR扩增产物与液相芯片进行杂交,并通过液相芯片检测仪读取检测结果。结果:同时检测多种肠道病毒(EV),肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CAV16)的病毒核酸最低检出量均为1pg,检测特异性高。与参照方法相比,EV、EV71、CAV16的检测灵敏度分别为:91.4%、92.9%、100.0%,检测特异度分别为100.0%、97.1%、98.2%,检测准确度分别为:100.0%、96.3%、87.5%。结论:构建的检测手足口病病原的液相芯片方法,具有高通量、灵敏度高、特异性强和检测时间短等优点,为手足口病的快速诊断奠定了基础。

逆转录-环介导等温扩增技术结合横向流动试纸条法快速检测肠道病毒

目的建立一种快速特异敏感的肠道病毒检测方法。方法针对肠道病毒保守区基因序列,设计6条逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)特异性引物,经过优化,用毛细管电泳及横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物,建立RT-LAMPLFD检测方法,并与荧光定量PCR法进行比较。结果 LFD与毛细管电泳法检测特异的RT-LAMP扩增产物具有同样的敏感度,RT-LAMP-LFD法检测肠道病毒与其他病毒无交叉反应,最低检出限为10拷贝RNA分子,与荧光定量PCR法检测结果一致性为99.2%。结论建立的RT-LAMP-LFD方法,具有较高的特异性及灵敏度,操作简单、快速且不需要昂贵的仪器设备,适合应用于基层实验室肠道病毒的快速检测。

甲型H1N1(2009)流感流行后流感样病例呼吸道病原检测分析

目的:了解甲型H1N1(2009)流感流行后的流感样病例(ILI)中,除流感病毒外的相关病原分布,为ILI患者临床治疗、流行病学调查提供参考。方法:收集流感监测哨点医院393份ILI咽拭子标本提取核酸,应用实时荧光PCR方法进行20种相关病原比对检测,分析各病原的阳性率与构成比。结果:检测出阳性咽拭子标本51例,分属13种共计64株病原体,其中阳性率较高的为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、冠状病毒。另有13例为两种病原体混合感染,占阳性标本数的25.49%。结论:ILI的病原构成比较复杂,且存在混合感染,临床治疗与流行病学调查均应引起重视。

老年慢性阻塞性肺疾病急性加重病人病原体分布特点的单中心回顾性研究

目的了解老年慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)病人病原体分布特点及病原学相关性,以指导临床合理使用抗生素及激素。方法回顾性分析2019年1月至2020年1月期间南京市第一医院收治的老年AECOPD病人共111例,收集血常规中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞计数、CRP、红细胞沉降率(ESR)等基本资料,并进一步收集合格痰荧光定量PCR病原学,同时了解AECOPD病人的病原学分布,并分析病原学之间的相关性。结果AECOPD病人病原学阳性组与阴性组比较,ESR、心血管疾病比例差异有统计学意义。AECOPD病人中病原体检出率前5位分别为EB病毒(21.6%)、流感嗜血杆菌(19.8%)、肺炎链球菌(17.1%)、单纯疱疹病毒(14.4%)、甲型流感病毒(14.4%)。甲型流感病毒检出率与乙型流感病毒和曲霉菌相关(P<0.05);呼吸道合胞病毒的检出率与念珠菌、卡他莫拉菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌相关(P<0.05);大肠埃希氏菌的检出率与鼻病毒、腺病毒、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌相关(P<0.05);念珠菌检出率与卡他莫拉菌及铜绿假单胞菌相关(P<0.05);人冠状病毒检出率与流感嗜血杆菌、单纯疱疹病毒和肺炎链球菌相关(P<0.05)。结论老年AECOPD多由细菌和病毒混合感染等诱发。通过分析老年AECOPD病人的病原体,有助于指导抗生素合理使用。

2013—2014年南京市流感病毒H3N2亚型血凝素分子遗传特性分析

2013-2014年南京市流感病原监测系统分离到31株流感病毒H3N2亚型毒株,通过提取病毒RNA,反转录―聚合酶链反应（reverse transcriptase―polymerase chain reaction,RT―PCR）扩增血凝素（hemagglutinin,HA）基因片段,进行PCR产物纯化、测序并分析其遗传进化特征.结果显示,31株分离株与疫苗株A/Texas/50/2012之间的核苷酸和氨基酸进化距离分别为0.0102和0.0121,核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.9%~99.6%和97.2%~99.3%.遗传进化分析表明,分离株的HA基因分属不同的进化分支,3株2013年分离株属3B基因型,3株2014年分离株属3C.1基因型,2株2014年分离株属3C.2b基因型,其余23株属3C.3a基因型.与疫苗株相比,分离株的分子特征表现为发生N128A/T和P198S/A（去信号肽排列）氨基酸位点变异,均位于抗原决定簇B;分离株抗原决定簇上发生变异的位点共计24个;7株分离株出现126 NWT糖基化位点,3株分离株糖基化位点45NSS和144NNS消失.结果提示,2013-2014年南京市流感病毒H3N2亚型的HA基因较疫苗株发生了较大变异,疫苗对病毒的预防效果需重新评估.

含肠道病毒5'端非编码区部分核糖核酸序列病毒样颗粒的构建

目的构建含有肠道病毒(EV)5'端非编码区(5'-UTR)部分RNA序列的耐核糖核酸酶(RNase)病毒样颗粒。方法利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2。将肠道病毒5'-UTR基因片段连接到中间载体的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV。将其转化宿主菌,IPTG诱导表达,并进行RT-PCR检测和稳定性实验。结果表达载体pET32a-MS2-EV经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。RT-PCR和稳定性实验结果表明,诱导产生的病毒样颗粒内含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列,并且稳定性良好。结论成功构建了含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列的病毒样颗粒,可作为肠道病毒检测时的标准品和质控品使用。

一起甲型副伤寒暴发菌株的基因组遗传和耐药特征

目的了解2016年江阴市一起甲型副伤寒暴发菌株的基因组遗传和耐药特征。方法采用二代测序技术(NGS),对分离到的9株菌株进行全基因组测序。经数据过滤和de novo组装后,获得基因组序列。将其与公共数据库下载国内流行株和国际参比菌株比较,获取单拷贝核心基因序列SNP,构建系统发生树。同时通过比对MLST数据库,获取MLST分型情况;通过比对ResFinder数据库和ARDB数据库获取耐药基因携带情况。采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行15种临床常用抗生素敏感性测试。结果组装后9株甲型副伤寒菌株均为4.5M左右,且均为ST85型;系统发生树分析显示这9株菌株聚在一起,且同云南元江甲型副伤寒暴发菌株的亲缘关系最近。9株菌株均对四环素、氯霉素、复方新诺明、萘啶酸、红霉素和阿奇霉素耐药,均携带了介导氨基糖苷类耐药的aac(6′)-Iaa基因,以及介导喹诺酮类耐药的gyrA p、S83F和parC p.T57S突变,同时还携带ABC、RND和MF家族外排泵相关的耐药基因。结论本暴发疫情是由共同来源的、具有多重耐药性ST85型甲型副伤寒沙门菌引起。应用基因组数据可更精细分析菌株遗传进化特征、亲缘关系及耐药基因携带情况,对临床用药有一定指导作用。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 StxⅡ基因表达

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7StxⅡ基因表达,并评价其对细菌生长的影响及细胞毒性。方法针对EHEC O157∶H7StxⅡ基因设计引物,构建CRISPR/Cas9表达质粒pdCas9-StxⅡ并转化EHEC O157∶H7感受态细胞,采用RT-PCR及胶体金法检测StxⅡ基因表达情况,绘制菌株生长曲线,将菌株培养上清液接种Vero细胞观察细胞病变情况。结果测序分析显示pdCas9-StxⅡ表达质粒被成功构建;转化EHEC O157∶H7(00G097)感受态细胞后,StxⅡ基因mRNA、蛋白表达均受抑制,EHEC O157∶H7生长曲线未受影响(P值均>0.05)。pdCas9-StxⅡ-00G097菌株培养上清液对细胞的毒性效应(CPE为30%)显著低于对照菌株00G097和pdCas9-00G097(CPE均>80%)。结论成功构建的pdCas9-StxⅡ表达质粒能特异抑制EHEC O157∶H7StxⅡ基因表达、降低细胞毒性,为进一步研究志贺毒素StxⅡ在EHEC O157∶H7致病机理和基因工程减毒活菌苗奠定了基础。