构建转天冬酰胺酶基因菌株及其固体发酵产酶培养基优化

构建一株转L-天冬酰胺酶基因的里氏木霉重组菌株,并采用固体发酵的方法研究其发酵产酶。首先以贝莱斯芽孢杆菌质粒为骨架重组天冬酰胺酶基因,验证其天冬酰胺酶的表达;随后探讨不同培养基配方(配方1和配方2)发酵产酶效果,通过单因素和正交试验优化其优势产酶培养基。结果表明:构建的里氏木霉可以正确表达天冬酰胺酶;在固体培养基配方1和配方2中,重组的里氏木霉菌株发酵产天冬酰胺酶分别为4.52 U/g和2.21 U/g,配方1产酶量远高于配方2。因此,以配方1作为优选配方,通过单因素及正交试验对其进一步优化。配方1中,当麦麸与玉米芯的比例为3∶1、初始含水量为1∶4.4、初始pH值为5.5时,该里氏木霉转L-天冬酰胺酶基因重组菌株发酵产酶活力为5.965 U/g,与原配方相比,优化后的固体培养基发酵产酶活力提高了24.22%。

纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件研究

本研究通过γ射线照射和亚硝基胍交替处理 ,诱变出一株纤维素酶高产菌株T80 1 ,与出发菌株相比 ,其产酶能力提高 1 77倍。通过对诱变菌株产纤维素酶条件研究发现 ,以稻草粉为碳源、蛋白胨为氮源时 ,菌株产酶最高。该菌株产酶最适培养温度为 2 8℃～ 30℃ ,最适培养 pH为 4 8～ 5 0 ,在此条件下发酵五天达到产酶高峰。该诱变株产酶能力高于国内外一些已知的纤维素酶高产菌株如QM941 4等 ,具有重大的实用价值。

啤酒酵母AS2.1416海藻糖合成酶基因tps1的cDNA克隆及序列分析

The trehalose 6 phosphate synthase gene tps 1 was amplified from yeast S.cerevisiae AS2.1416 cDNA library by polymerase chain reaction.This 1.5 kb fragment was cloned into Pst I and Bam HI sites of pGEM T easy vector and the sequence of the gene indicated the cloned tps 1 gene contained 1485 nucleotides encoding for 495 amino acid and shared a sequence homology of 99.6% with that from S.cerevisiae S288C.

固定化青霉素V酰化酶的制备及性质

尖镰孢（ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕ ｍ）ＦＰ９４１ 青霉素Ｖ 酰化酶经γ氧化铝吸附洗脱、硫酸铵沉淀和脱盐处理后，固定在环氧丙烯聚合物载体上，湿固定化酶表现活力为２１７ ＩＵ／ｇ ，固定化产率为５３ ％ 。固定化酶作用最适温度为５５ ℃，最适ｐＨ 为８０ ；在ｐＨ５０ ～１１０ 及５０ ℃以下稳定；３７ ℃使用２５ 次后，酶活力保留９０ ％ 。

啤酒糖酵母菌6-磷酸海藻糖合成酶编码基因tps1的cDNA克隆

本工作从抗逆性极强的啤酒糖酵母菌株 Ａ Ｓ２１４１６ 中分离纯化总 Ｒ Ｎ Ａ 和 ｍ Ｒ Ｎ Ａ ，以 Ａ Ｍ Ｖ 逆转录酶合成了单链ｃ Ｄ Ｎ Ａ 。采用保守引物扩增并克隆了该酵母菌的６ － 磷酸海藻糖合成酶编码基因ｔｐｓ１ ，建立了该基因 Ｄ Ｎ Ａ 片段的物理图谱，发现其酶切位点与已见报道的６ － 磷酸海藻糖合成酶编码基因相同。

多头绒泡菌中动蛋白的免疫化学鉴定

动蛋白(kinesin)是一种微管系统的运动蛋白(motor protein),它能通过水解ATP将化学能转化为机械能,推动微管产生运动.微管系统作为一种主要的细胞骨架存在于所有真核细胞中,它们对于维持细胞形态,细胞的分裂,染色体的运动及细胞内的物质运输起着重要作用.细胞质力蛋白(dynein)和动蛋白是公认的推动这类运动的运动蛋白.自从1985年Vole首次在鱿鱼大轴突(squidgiant axon)中发现动蛋白以来,人们先后在许多种动物细胞中发现有动蛋白存在,甚至在低等真核生物棘状变形虫,盘基网柄茵和高等植物烟草花粉管中发现有动蛋白的存在.研究结果表明,动蛋白参与了真核细胞中的许多重要生命活动,如细胞中的细胞器及囊泡的运动,染色体排裂和分离等运动.动蛋白很可能是普通存在于所有真核细胞中的一种运动蛋白.多头绒泡菌(Physarum poly-cephalum)属于粘菌纲(Myxomycetes)的一种低等真核生物,它表现出许多显著的细胞运动特征如原生质团迁移,细胞质的穿梭运动(shuttle streaming)等,是研究非肌细胞运动和收缩蛋白的经典材料.在多头绒泡菌胞质中也具有微管系统,它们构成其纺锤丝等,参与染色体的运动及其它胞质运动,但至今国内外尚无人证明其中有与微管作用的运动蛋白——动蛋白的存在,作者利用抗牛脑动蛋白的单克隆抗体,

多头绒泡菌肌球蛋白的纯化及性质的研究

从多头绒泡菌中纯化了肌球蛋白，并对其亚基组成及ＡＴＰ酶性质进行了研究。该肌球蛋白是由一种重链（２２５ｋＤ）和两种轻链（２０ｋＤ，１７．５ｋＤ）组成的大分子，其亚基之比为ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２＝２：４：２。兔肌Ｆ－肌动蛋白能较大激活粘菌肌球蛋白ＡＴＰ酶活性，Ｃａ^（２＋）离子也能提高其活性，Ｍｇ^（２＋）离子无明显影响。钒酸盐，碘乙酸，对氯汞苯甲酸对其ＡＴＰ酶活性有显著抑制作用。

低分子肝素钙在重度感染患者中的应用

目的:探讨低分子肝素钙联合胸腺肽a1在多器官功能障碍综合征(MODS)合并重度感染患者中治疗效果。方法:对本院2014-2015年ICU病房的MODS患者149例给予低分子肝素钙4100U皮下注射,每日2次,联合胸腺肽a1 1.6mg皮下注射,每日1次,疗程7d;其过程中对肝功能、血气分析、PT(凝血酶原时间)、Fib(纤维蛋白原)、血常规等进行监测统计分析。结果:其中93例(62.41%)患者有明显的血流动力学改变,低氧血症得到有效控制且呼吸功能指标有较大好转;94例DIC患者(63.08%)凝血指标显著好转,各项检测指标在治疗前后具有显著差异,20例死亡(13.4%)。结论:无明显出血倾向情况下可使用低分子肝素钙和胸腺肽a1对MODS尤其是重度感染患者进行安全、有效的治疗。

超氧化物歧化酶(SOD)的应用研究进展

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,简称SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中,是一种重要的抗氧化剂,保护暴露于氧气中的细胞。近年来,SOD在农业和医药等多个领域都展现出了巨大的应用价值和开发前景。对SOD的功能、抗氧化机制、类型以及生产方式等进行了概述,并重点综述了SOD在工业(医药工业,食品和日化工业)和农业上的的应用情况及发展潜力,以期为我国SOD产品的深入开发和利用提供参考。

里氏木霉内切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用外显子拼接的方法,以里氏木霉Trichoderma reesei基因组 DNA 为模板,克隆出内切-1,4-β-D-葡聚糖酶II基因egl2的全编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pQY2025。重组质粒线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达内切葡聚糖酶II的毕赤酵母工程菌株Gp2025。用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,培养基中内切葡聚糖酶II的活力可达1573.0U/mL,同时对重组内切葡聚糖酶II的性质进行了初步研究。

国产线形缝合器在肺切除术中的应用

目的：评价国产线形缝合器在肺切除术中应用的可靠性及经济性。方法：自2000.7-2001.10月，在18例肺切除术中应用国产线形缝合器（江苏省常州市能源医卫器材总厂生产的XF30线形缝合器）闭合主支气管及叶支气管，与此前应用常规手工缝合支气管残端的方法在缝合时间，支气管残端漏气及出血，术后病人的咳嗽程度进行对比观察，并与进口一次性缝合器的性能，价格进行比较。结果：18例支气管残端闭合平均需时约15秒，均一次成功，所有病例闭合支气管残端后用麻醉机气管内加压至40cm水柱试验均无漏气，切除病肺后也无支气管动脉出血，术后病人无明显的刺激性咳嗽，达到了文献报道的用一次性进口缝合器闭合支气管残端的效果，且费用只是其二十分之一，结论：国产线形缝合器应用于肺切除术中闭合支气管残端是安全有效的，完全能达到进口缝合器的应用效果。且价格低廉，完全能被广大患者及医生接受，易于广泛使用。

多粘芽孢杆菌 (Bacillus polymyxa) β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析

从多粘芽孢杆菌 (Bacilluspolymyxa 1 794 )中克隆得到 β_葡萄糖苷酶基因bglA。将其构建在大肠杆菌 (Es cherichiacoli)表达载体pET2 8a(+)上 ,转化E .coliBL2 1,获得重组工程菌BL1979。重组表达的 β_葡萄糖苷酶的酶活力达到 2 4 7IU mL ,经镍柱纯化后的 β_葡萄糖苷酶最适温度为 37℃ ,最适pH值为 7 0 ,该酶经纯化后纯度可达92 7%。用非变性梯度聚丙烯凝胶电泳发现该酶具有多种寡聚体形式 ,经荧光底物活性染色表明这些寡聚体均具有

纤维素酶在木质纤维素生物质转化中的应用研究

选育得到纤维素酶高产菌株里氏木霉突变菌株 (Trichodermareesei) 81 3A ,优化了其发酵产酶条件。利用该菌株所产纤维素酶对天然木质纤维素的水解糖化过程进行研究 ,确定了实验条件下最优的糖化条件 (温度 5 0℃ ,pH 4 5 ,酶浓度 6～ 8FPU mL ,底物浓度 2 % )。以玉米叶和杨树叶为天然纤维素原料 ,水解糖化率分别达到 86 2 %和 5 6 0 %。通过酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)将糖化液转化为酒精 ,产乙醇浓度达到 5 %～ 5 8% ,转化率为79 4 %～ 92 1 %。

荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组BAC文库的构建与分析

采用未培养技术和脉冲场电泳技术直接从瘤胃微生物提取到大小在2Mb左右混合微生物DNA,经HindⅢ不完全酶切获得50～100kbDNA片段,将其连接在pCC1BAC载体上,转化E.coliEPI300,得到瘤胃微生物BAC文库,经对文库的鉴定分析,该文库的平均插入片段54.5kb,空载体率小于2%,库容837Mb,共保存15360个克隆。通过对该文库进行部分酶活性筛选,获得具有淀粉酶活性的克隆16个;纤维素酶活性的克隆26个,而且能降解纤维素的克隆中25个呈现多酶活性。这些结果表明该文库具有重要研究价值。

采用未培养技术对荷斯坦奶牛瘤胃细菌多样性进行初步分析

采用未培养(Culture independent)技术直接从荷斯坦奶牛瘤胃液中提取瘤胃细菌微生物混合DNA(也叫元基因组DNA),利用细菌16SrDNA通用引物27F与1492R,扩增瘤胃混合微生物的16SrDNA,根据16SrDNA序列对瘤胃细菌多样性进行初步分析。通过16SrDNA序列同源性分析,发现有多于一半以上的序列与可培养的菌株的同源性小于90%,属于不可培养的菌株。选用45条测得序列与已知序列构建系统发育树,分析结果表明,它们分属于两大类LGCGPB(the lowG+CGram positivebac teria)和CFB(Cytophaga_Flexibacter $CBacteroides group),剩下的克隆尚难确定其分类地位,可能是代表新属和种的序列,这些序列已向GenBank提交并得到序列号(AY986777_AY986791)。

耐碱性木聚糖酶基因在短小芽孢杆菌中高效分泌表达的研究

从木聚糖酶高产短小芽孢杆菌 (Bacilluspumilus)BP5 1中克隆得到木聚糖酶基因xynA ,将其构建在芽孢杆菌表达载体pWH1 5 2 0中得到重组质粒pWSX1 1。xynA由木糖诱导xylA启动子调控xynA表达。采用同源高效表达策略 ,以原生质体转化方法将pWSX1 1转回原始菌株BP5 1中 ,获得重组菌株BPX1 1。通过木糖诱导重组菌株中的xy nA基因高效分泌表达 ,使木聚糖酶产酶活力比原菌株BP5 1提高了 87% 。

云南腾冲热泉土壤微生物基因组文库的构建与分析

采用冻融、蛋白酶K、SDS-高盐-加热处理法联合的方法，直接从云南腾冲地区的一个弱碱性高温热泉沉积样品中提取和分离环境混合基因组DNA，产量为每克样品1～2μg DNA，用Promega试剂盒纯化后进行PstⅠ部分酶切处理，电泳回收3～8kb的片段后，构建了pSK（＋）为载体的基因组文库，共获得25000个阳性克隆，平均插入片段长度为4．6kb。通过随机DNA序列测定和基因注释，发现外源插入片段含有未见报道的序列。

中国大陆科学钻探(CCSD)地下岩心样品中的细菌群落分析

通过建立高效率的微生物未培养DNA提取技术和16SrDNA分析技术,在中国大陆钻探深层岩芯中发现微生物存在的证据。从地下430.00米(S1)与1033.77米(S13)深度岩芯中分别提取到微生物DNA,进行16SrDNAPCR扩增,通过对S13样品DNA中克隆得到的54个16SrDNA的序列测定,初步构建了该深度地下微生物群落的系统进化树,发现了23种不同的微生物序列存在。通过DAPI染色证明在地下1033.77米的微生物数量约为1×104个/克岩石,采用实时定量PCR分析分析,发现了其中两种微生物(CCSD1305与CCSD1307)的数量为6.6×104+/g岩石与2.18×106个/g岩石。

中国大陆科学钻探(CCSD)微生物研究——地下3900米一株细菌的分离与鉴定

在中国大陆科学钻探科钻一井的3911.28米处利用厌氧培养基分离到一株细菌CCSDFL3900,该菌的最适生长温度为65℃,兼性厌氧,革兰氏染色为阴性,端生芽孢,不运动,电镜观察无鞭毛。利用细菌16SrDNA通用引物对其16SrRNA进行PCR扩增,16SrRNA序列及其进化树分析结果显示,该菌为芽孢杆菌或地杆菌。生化试验检测显示,该菌株能够利用多种糖类发酵产酸,最终鉴定为热坚芽孢杆菌。