3型哺乳动物正呼肠孤病毒SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用

哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)是双链RNA病毒,可以感染自然宿主的哺乳动物和脊椎动物。为建立一种针对3型哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV-3)的特异且快速的检测方法,本研究根据Genbank登录的MRV-3(OQ627746-OQ627755)S1基因保守区设计1对特异性引物,并从MRV-3中扩增S1基因,构建重组质粒p MD18-S1,经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品,经反应体系及反应条件优化后首次初步建立了检测MRV-3的SYBR Green I荧光定量PCR(q PCR)方法。将质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板经该q PCR扩增,建立标准曲线,结果显示,质粒标准品在1.3×10^(8)拷贝/μL~1.3×10^(3)拷贝/μL与各自的Ct值均呈良好的线性关系,斜率为-3.1706,R^(2)为0.9999,熔解曲线为单峰。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、水牛匈爱病毒(Buf Hu V)、牛冠状病毒(BCo V)、牛细小病毒(BPV)和MRV-3的基因组DNA/c DNA为模板,利用本研究建立的q PCR方法检测,评估该方法的特异性;将质粒标准品10倍倍比稀释至1.3×10^(2)拷贝/μL~1.3×10^(8)拷贝/μL后作为模板,分别利用本研究建立的q PCR和常规PCR检测,比较两种方法的检测结果,评估本研究建立q PCR方法的敏感性;以1.3×10^(3)拷贝/μL~1.3×10^(7)拷贝/μL 5个不同浓度的质粒标准品为模板,利用该方法分别进行批内和批间的重复性试验,评估该方法的重复性。结果显示,该方法只能检测出MRV-3,其他相关病原的检测结果均为阴性;该q PCR对质粒标准品的检测限为1.3×10^(3)拷贝/μL,比常规PCR敏感性高10 000倍;批内和批间重复性试验的变异系数均小于或等于1.0%,表明该q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好。利用该方法检测220份牛粪便样品,结果显示MRV-3的检出率(3.64%,8/220)高于常规PCR的检出率(1.36%,3/220),两种检测方法的阳性符合率达100%,阴性符合率为97.75%,总符合率为97.78%。综上所述,本研究首次建立的检测MRV-3的SYBR Green I q PCR方法可以用于临床牛腹泻病原的检测,为MRV-3尤其是牛源MRV-3提供了一种快速灵敏的检测手段,也为MRV-3的后续研究奠定了基础。

广西地区1株牛细小病毒1型分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解广西地区牛细小病毒1型(Bovine parvovirus 1,BPV1)的生物学特性及遗传变异情况,为BPV1的防控提供理论依据和支撑。【方法】试验从广西地区养牛场采集409份犊牛腹泻粪便样本,通过BPV1特异引物进行PCR检测,使用牛鼻甲骨细胞(BT)对阳性样品进行病毒分离。收集产生细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)的BT细胞上清液,通过PCR扩增、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)、电镜观察等方法进行病毒鉴定。测定BPV1分离株感染BT细胞后不同时间病毒半数组织培养感染剂量(median tissue culture infectious dose,TCID_(50)),绘制病毒多步生长曲线。利用高通量测序获得病毒全基因组序列并对其进行遗传进化分析。【结果】409份粪便样本检测到1例BPV1阳性,阳性率为0.24%。病料接种BT细胞盲传至第3代,可观察到细胞圆缩、弯曲、形成细胞团块、溶解等现象。PCR扩增结果显示,产生CPE细胞上清经PCR扩增可出现特异性条带;电镜可观察到圆形、无囊膜、直径约24 nm的病毒粒子;IFA结果显示,接种分离株的BT细胞内可观察到特异性绿色荧光,成功分离到1株BPV1,命名为GXBS2209。第6代分离株病毒滴度为10^(5.75)TCID_(50)/mL,多步生长曲线显示分离株感染BT细胞后病毒滴度在120 h达到峰值,随后逐渐下降。测序结果显示,分离株基因组全长为5515 bp(GenBank登录号:PP158225),与美国Bovine parvovirus株全基因组序列相似性最高,为98.7%。遗传进化分析结果显示,分离株与Bovine parvovirus株处于同一分支,亲缘关系最近。分离株与参考毒株NS1、VP2基因核苷酸序列相似性分别为98.8%~99.4%、94.4%~98.1%,氨基酸序列相似性分别为98.8%~99.5%、90.3%~99.4%;NS1和VP2序列中各有2和3个氨基酸位点替换。【结论】本研究成功分离到1株BPV1,并对其全基因序列进行分析,为后续BPV1的致病机理、疫苗研究以及疾病防控奠定了基础。

猪星状病毒nsP1a/4蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

为了获得猪星状病毒(Porcine astrovirus,PAstV)重组蛋白nsP1a/4和多克隆抗体nsP1a/4,试验采用PCR技术扩增得到nsP1a/4基因片段,通过双酶切技术鉴定重组表达质粒nsP1a/4-pET-32a。利用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞表达重组蛋白nsP1a/4,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白nsP1a/4表达情况及可溶性。利用Ni-Agarose Resin纯化重组蛋白nsP1a/4,再通过Western-bolt验证。以纯化的重组蛋白nsP1a/4免疫健康新西兰大白兔制备多克隆抗体nsP1a/4,通过Western-bolt检验多克隆抗体nsP1a/4的特异性。结果表明:试验扩增出nsP1a/4基因片段,成功构建出重组表达质粒nsP1a/4-pET-32a,重组蛋白nsP1a/4以包涵体形式在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中大量表达。经Ni-Agarose Resin纯化的重组蛋白nsP1a/4单一,Western-bolt成功鉴定到重组蛋白nsP1a/4,多克隆抗体nsP1a/4能与重组蛋白nsP1a/4发生特异性结合。说明试验成功制备出PAstV的多克隆抗体nsP1a-4。

牛匈爱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

水牛匈爱病毒(BufHuV)是2021年在广西水牛中新发现的一种小核糖核酸病毒,本研究旨在建立一种可用于临床快速且特异检测牛匈爱病毒的方法。基于GenBank上公布的bovine hunnivirus、ovine hunnivirus和BufHuV的5′UTR保守区设计了1对特异性引物,首次建立了检测牛匈爱病毒的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果表明,标准曲线在1.1×10^(8)copies/μL~1.1×10^(3)copies/μL质粒标准品稀释浓度范围内呈线性关系,斜率为-3.2657,相关系数为0.9998,熔解曲线为单峰,检测下限为1.1×10^(1)copies/μL,比常规PCR敏感性高100倍;特异性高,与多种常见的牛病病毒均无交叉反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于1.0%。收集了257份有腹泻迹象的牛粪样品,用于对所建立平台的性能评估,结果,建立的实时荧光定量PCR的阳性检出率为3.89%,高于普通PCR的阳性检出率(1.56%)。上述结果表明,该方法将为牛匈爱病毒的临床样品检测、流行病学监测提供一种快速、可靠、低成本的替代方案,也为后续研究奠定了基础。

猪星状病毒3型TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为了建立特异、灵敏及快速的猪星状病毒3型(PAstV3)检测方法并应用于临床检测,根据GenBank登录的PAstV 3序列,在ORF1b保守区设计特异性引物和TaqMan探针;经过反应体系和反应条件优化,对建立的实时荧光定量RT-PCR方法进行敏感性、特异性测定,并初步应用于临床粪便样品的检测。结果显示,该方法标准曲线线性关系良好,R2值达到0.997 1;与多种常见的猪病病毒均无交叉反应,特异性良好。与常规PCR相比,该检测方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高,批内、批间重复性试验的变异系数均小于2.0%,重复性良好。使用该方法对临床收集的30份疑似PAstV3粪便样本进行检测,阳性率为40%,检出率高于常规PCR方法。上述结果表明,该方法的建立为PAstV3的诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。

牛星状病毒神经型与肠道型ORF2蛋白原核表达及间接ELISA的建立与初步应用

通过GenBank中登录号(神经型BufAstV-GX-NN-ORF2-14、肠道型BufAstV-GX-NN-ORF2-12)合成神经型ORF2-14-1与肠道型ORF2-12-1基因序列,运用PCR技术扩增神经型ORF2-14与肠道型ORF2-12目的片段的基因并克隆到pET-32a(+)载体,成功构建了重组质粒神经型pET-32a-ORF2-14与肠道型pET-32a-ORF2-12,经鉴定正确后转化BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达,纯化后的重组蛋白利用SDS-PAGE、Western blot进行鉴定。以纯化的神经型pET-32a-ORF2-14与肠道型pET-32a-ORF2-12重组蛋白为诊断抗原,成功建立牛星状病毒(bovine astrovirus,BoAstV)神经型与肠道型的间接ELISA抗体检测方法。运用建立的间接ELISA对2019-2020年广西部分地区采集的712份牛血清进行BoAstV抗体的检测,结果显示肠道型共检出170份抗体阳性血清,BoAstV抗体阳性率为23%;神经型共检出124份抗体阳性血清,BoAstV抗体阳性率为17%;其中,2种型共同感染阳性率占总份数10%。结果表明,本试验成功建立了对BoAstV的神经型与肠道型分型检测方法,为临床上对BoAstV分型检测提供良好的检测方法打下基础。