葡萄浆果内坏死病毒RT-q PCR检测技术建立及其在葡萄砧木中的时空分布规律

【背景】葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus,GINV)是近年来在中国报道的一种正单链RNA病毒,该病毒发生普遍且危害严重。高灵敏的检测技术是病毒田间监测和无病毒苗木培育的关键。【目的】建立灵敏度较高的GINV逆转录实时荧光定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测体系;明确不同葡萄砧木对GINV的敏感性;明确GINV在寄主植株中的时空分布规律,为该病毒的监测预警提供技术支撑。【方法】根据GenBank已登录GINV的复制酶(replicase,RP)、移动蛋白(movement protein,MP)和外壳蛋白(coat protein,CP)基因保守序列设计6套引物,通过常规RT-PCR和RT-qPCR筛选特异性强、扩增效果好的引物。再通过对退火温度和引物浓度等反应条件的优化建立GINV的SYBR Green I染料法RT-qPCR检测体系,并进一步对该技术的灵敏度、特异性和田间适用性进行评价。将GINV接种到贝达、SO4、101-14、140R和1103P 5种葡萄砧木上进行症状观察和病毒检测,以筛选GINV敏感性较高的指示植物。基于所建立的RT-qPCR技术对接种GINV葡萄砧木的不同生长时期、不同部位样品进行GINV检测,从而明确GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。【结果】建立了GINV SYBR Green I染料法RT-qPCR检测技术体系,其最佳引物为GINVRPYGF2/R2,最佳引物浓度为300 nmol·L^(-1),最佳退火温度为58.4℃。该技术对GINV的检测特异性强,其检测灵敏度达常规RT-PCR的1 000倍。症状观察结果表明贝达感染GINV的症状最为严重,表现为叶片系统性坏死,而其他砧木叶片仅表现褪绿斑驳和环斑症状。RT-qPCR检测结果表明GINV在EL27时期(坐果期)的相对含量最高,5个品种间的病毒相对含量在EL12(花序分明期)和EL27时期间无显著差异,EL31时期(果实增大期)的贝达与SO4、101-14、140R和1103P的病毒相对含量存在显著差异;GINV的相对含量在不同组织部位存在较大差异,由高到低依次为下部叶片、上部叶片、上部茎秆、下部茎秆、根部。【结论】建立了灵敏度高、特异性强的GINV RT-qPCR检测方法,利用该方法明确了GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。

我国葡萄扇叶衰退病相关病毒研究进展

葡萄扇叶衰退病(grapevine fanleaf degeneration disease,GFDD)是葡萄栽培中常见的病毒病害,在我国葡萄产区发生普遍,危害严重。引起该病的病毒种类有10余种,症状表现受葡萄品种、病毒种类、栽培条件等多种因素影响。由于高通量测序技术的发展与应用,我国鉴定发现了除葡萄扇叶病毒(grapevine fanleaf virus,GFLV)之外的3种GFDD相关病毒,即葡萄浆果内坏死病毒(grapevine berry inner necrosis virus,GINV)、灰比诺葡萄病毒(grapevine Pinot gris virus,GPGV)和葡萄蚕豆萎蔫病毒(grapevine fabavirus,GFabV)。系统综述了我国GFDD的主要病原及其侵染状况,可为该病害的精准防控提供参考。

5种苹果病毒多重PCR检测体系的建立

苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果坏死花叶病毒(ApNMV)和苹果锈果类病毒(ASSVd)是影响我国苹果产业健康发展的重要病毒病害,建立快速、准确的检测方法是防控病毒病的基础。分别设计了ACLSV、ApNMV和ASSVd 3种病毒的检测引物ACL-F1/R1、ApN-F2/R2和ASS-F1/R1,片段的大小分别为1112、1025、213 bp。利用新设计和已报道的苹果病毒特异性引物,通过引物检测效果比较、组合筛选、用量优化及退火温度调试,建立了5种苹果病毒多重PCR检测体系。该检测体系的扩增片段大小分别为ACLSV1112 bp、ApNMV640 bp、ASGV449 bp、ASPV349 bp和ASSVd213 bp。利用多重PCR和单一PCR分别对50份田间苹果样品进行病毒检测,结果显示,各样品多重PCR检测与单一PCR检测结果一致,表明本研究建立的多重RT-PCR方法可准确、快速、高效地检测单一或复合侵染的5种苹果病毒。

苹果茎沟病毒侵染对嘎拉苹果果实品质的影响

为了明确苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)侵染对苹果果实品质的影响,以单一接种ASGV的嘎拉苹果盆栽树为材料,测定果实单果重、纵横径、硬度、维生素C、可溶性固形物、糖酸组分、花色苷组分以及香气物质含量等。结果表明,与健康植株相比,感染ASGV植株的果实纵横径无明显变化,单果重、果实硬度、可溶性固形物含量和可溶性糖含量显著降低,有机酸含量增加,香气组分占比发生改变,果皮中4种花色苷的含量均显著降低。

沙地葡萄茎痘相关病毒RT-PCR检测

为建立快速、灵敏、可靠的沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)检测方法,以总RNA为模板,采用2组GRSPaV特异性引物对29个品种52株葡萄样品进行RT-PCR检测,并对扩增产物进行了测序和分析。结果表明,从20个品种25株葡萄样品中检测到GRSPaV,平均带毒株率为48.1%。外壳蛋白基因片段引物F1/R1从25个样品中扩增到905bp的特异片段,复制酶基因片段引物F2/R2从20个样品中扩增到498bp的特异片段,表明GRSPaV外壳蛋白基因比复制酶基因更加保守,RT-PCR检测时采用F1/R1则更为适宜。PCR产物测序结果与GenBank中登录的GRSPaV序列比较,同源性为97.90%～98.11%。

梨树苹果茎沟病毒的脱毒技术研究

１９９３—１９９６年，采用热处理材料茎尖培养及试管苗热处理方法，对１３个梨品种及矮化砧材料进行苹果茎沟病毒脱毒试验的结果表明，二者对茎沟病毒的脱除率分别较单纯茎尖培养高５７．０％和６２．４％。脱毒苗生根率和移栽成活率分别达７０％和８０％。

葡萄卷叶病毒3 RT-PCR检测技术研究

采用改进的二氧化硅吸附法和2组特异性引物进行葡萄卷叶病毒3(GLR aV-3)RT-PCR检测。结果表明,二氧化硅吸附法提取总RNA纯度好、浓度高、操作简便;随机引物合成cDNA能同时用于多种病毒及不同引物的PCR,可简化检测程序,降低检测费用;LC 1/LC 2引物进行RT-PCR检测,病毒检出率高于PU/PD引物和EL ISA方法。建立了规范、灵敏、稳定、快速、经济的GLR aV-3RT-PCR检测技术体系。

我国葡萄病毒病研究进展及发展方向

我国葡萄病毒病研究始于20世纪80年代,内容涉及病毒病种类调查、病原分离与鉴定、检测技术、脱毒技术等诸多方面.本文对此作一简要综述,并初步展望了今后我国葡萄病毒病研究的发展方向.

苹果和梨树茎尖培养结合热处理脱病毒研究

1995～2000年,以18个苹果品种和15梨品种为试材,以茎尖培养结合热处理进行脱毒研究。用酶联免疫吸附法检测结果表明,苹果茎沟病毒和褪绿叶斑病毒脱毒率可分别达到75%以上和100%。现已获得16个苹果品种和6个梨品种的无病毒母本树。

发展葡萄无毒化栽培 控制病毒病危害

病毒病是影响葡萄生长发育、产量和品质的重要因素,栽培无病毒苗木是控制葡萄病毒病危害的根本措施。本文简要论述了世界葡萄病毒病研究与无毒化栽培概况、我国葡萄病毒病发生状况、葡萄病毒病的危害、无病毒苗木的优越性、我国发展葡萄无毒化栽培所具备的条件以及发展葡萄无毒化栽培存在的问题。

葡萄病毒病及其防治

葡萄是我国的主栽果树，近年来，生产规模迅速扩大，2007年栽培面积达43．84万公顷、产量达669．68万吨，分别比2000年增长了54．9％和104％。随着我国葡萄产业的迅速发展。葡萄栽培面积和苗木繁育数量急剧增加，与此同时，主要通过苗木和繁殖材料传播的嫁接传染性病害也进一步扩展蔓延，危害日益严重。

苹果优新品种无病毒母本树的培育

采用盆苗或试管苗热处理方法对昂林等16个苹果优新品种进行脱毒处理,采用木本指示植物2重芽接法和RT-PCR技术检测ASGV、ASPV和ACLSV 3种病毒,共获得11个苹果品种35株无病毒母本树,其中,盆苗热处理平均脱毒株率为46.1%,试管苗热处理平均脱毒株率为79.2%。

我国葡萄主栽区卷叶病相关病毒种类的检测分析

田间调查200个葡萄品种,结果82个品种表现葡萄卷叶病症状,其中欧亚种群表现葡萄卷叶病症状的品种最多,发病率最高,发病症状最重;欧美杂种发病率和严重度均比欧亚种群低;未发现美洲种群的品种表现葡萄卷叶病症状。从58株表现卷叶病的葡萄上采集休眠枝条进行卷叶病毒ELISA和RT-PCR检测,葡萄卷叶病毒-1,2,3,4,5和7(GLRaV-1,2,3,4,5和7)等6种葡萄卷叶病毒的检出率分别为20.7%,17.2%,62.1%,3.4%,5.2%和15.5%。回收PCR产物进行克隆和序列分析,并将测序结果提交至GeneBank。以葡萄卷叶病毒HSP70基因序列构建系统进化树分析其进化关系,GLRaV-1、3和7,GLRaV-2、4和5分别聚为2大类,其中GLRaV-1和3,GLRaV-4和5在各自的聚类中关系更近。

葡萄病毒脱除技术研究进展

葡萄是我国的一种重要果树,在长期的无性繁殖过程中受扇叶病、卷叶病、皱木复合病和斑点病等多种病毒病的危害,给葡萄的产量和品质带来了严重的影响。在生产上,无病毒的繁殖材料是控制病毒病的主要途径。总结了茎尖培养、热处理、化学处理、体细胞胚再生、电疗法和超低温脱毒等方法的脱病毒原理及在葡萄病毒脱除中的应用效果,分析了不同方法所适合脱除的病毒种类。通过对上述研究进展的综述,以期为我国葡萄病毒脱除技术研究提供参考信息。

地高辛标记cDNA探针检测苹果茎痘病毒

Partial sequence(314 bp) of ASPV was cloned and used as a probe labelled with digoxigenin-11dUTP.The total RNA extracted from samples with Apple stem pitting virus and a series of dilutions of plasmid with ASPV-cDNA were detected by dot blot hybridization.The results showed that the probe was sensitive and specific.The probe couldn’t hybridize with total RNA of Apple stem grooving virus,Apple mosaic virus and Apple chlorotic leaf spot virus samples as well as negative control,only hybridized with that extracted from dormant shoot infected with ASPV.The sensitivity for detection of plasmid contained ASPV-cDNA was 1.64 μg.