2021年~2022年我国猪盖塔病毒流行情况调查及其E2基因序列遗传变异分析

为了解2021年~2022年我国猪盖塔病毒(GETV)的流行现状和遗传变异情况,本研究对我国16个省份采集2512份临床样品,采用荧光定量RT-PCR方法进行GETV的检测,按照省份和地区进行GETV流行病学调查分析;采用RT-PCR方法对部分GETV阳性样品经PCR扩增E2基因并连接至p MD18-T载体并测序,利用DNAStar软件分析E2基因及其编码氨基酸序列与GETV参考株相应序列的同源性及其氨基酸变异情况;利用MEGA6.0软件构建E2基因的进化树,分析GETV的基因型及遗传进化关系。结果显示,7个省份猪群样品中均检测出GETV阳性样品,阳性率为3.34%(84/2512)。其中,陕西省和黑龙江省为首次在猪中检测到GETV。不同生长阶段猪中,仔猪GETV的检出率最高,达9.52%。同源性分析显示,获得的32个猪源GETV E2基因序列之间的同源性为98.3%~100%,与马来西亚GETV MM2021株相应基因序列的同源性为94.4%~94.9%。氨基酸序列变异分析显示,与参考株相比,本研究测序的E2蛋白有9个氨基酸位点只出现于猪源GETV。遗传演化分析显示,32个GETV株均属于III亚群,与III亚群内早期中国M1株、韩国QIAG9301株、日本Kochi等病毒株相比,本研究鉴定的GETV形成了新的进化分支。本研究揭示了我国当前猪群中GETV的感染现状及流行株的遗传变异情况,为该病毒的分子生物学研究和相关疫病防控策略的制定提供基础数据和参考依据。

山东地区1株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解并掌握山东地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)流行毒株的生物学特性和遗传变异情况,为BVDV防控提供理论依据和技术支持。【方法】采集养牛场疑似BVDV感染样品制备组织上清液,利用RT-PCR方法进行病原鉴定,接种MDBK细胞进行病毒分离培养,采用间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察对分离毒株进行鉴定,对分离毒株全基因组进行分段扩增、克隆和测序,并采用Lasergene等软件分别对全基因组序列、N^(pro)和E2基因进行比对和遗传演化分析。【结果】病料样品BVDV特异性引物RT-PCR扩增得到大小约504 bp的目的条带,与预期大小一致。IFA结果显示特异性绿色荧光;电镜下可见直径约50 nm的病毒粒子,表明分离到1株非致细胞病变型BVDV毒株,命名为SDNF9株。分离株基因组全长为12232 nt,与BVDV参考毒株的全基因组核苷酸相似性为79.1%~93.8%,其中,与中国分离毒株22AH-1和澳大利亚毒株Bega-like的相似性最高,为93.8%;N^(pro)和E2蛋白氨基酸存在多个位点变异;SDNF9分离毒株与BVDV2型毒株和BVDV3型毒株处于遗传演化的不同分支,而与BVDV 1型毒株处于同一分支,属于BVDV 1c基因型。【结论】本研究成功分离到1株BVDV 1c流行毒株,并进行基因组和遗传演化分析,与中国分离毒株22AH-1亲缘关系最近,为山东地区牛病毒性腹泻的防控和疫苗研制提供数据和材料支持。

我国部分省份牛冠状病毒HE基因遗传变异分析

2020-2023年收集我国14个省份78个临床发病牛群的肛拭子、粪便、组织等样品1819份,用实时荧光RT-PCR方法进行牛冠状病毒(BCoV)检测,并选取部分核酸阳性样品进行HE基因全长的扩增、测序与遗传变异分析。78个发病牛群中,BCoV阳性场占56.41%,共获得35条HE基因全长序列,与参考序列相比,核苷酸同源性为97.0%~100.0%,氨基酸同源性为97.0%~99.8%。系统进化分析表明,BCoV毒株HE基因在进化上呈现典型的地域性特点,亚洲毒株和美国毒株进化上较为接近,而欧洲毒株位于另一个分支,所测毒株与中国参考毒株处于亚-美型毒株分支中,位置相对较为集中。所测35个HE序列中,有34个没有发生插入或缺失突变,来自宁夏的BCoV/NX13/CHN/2023毒株其HE基因存在12个核苷酸的插入突变,证实了BCoV HE基因插入变异株在我国的存在。基因重组分析显示,该毒株与BCoV/HeB120/CHN/2021的HE基因可能发生了重组,预测重组值分别为0.797和0.759。说明了我国部分省份临床发病牛群BCoV感染及BCoV HE基因的遗传变异,为明晰我国BCoV流行毒株分子特征提供参考。

猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-RAA检测方法的建立及应用

为了建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验基于PEDV N基因保守区域设计3对特异性引物和1个探针,通过引物的筛选和反应温度的优化建立PEDV实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增(reverse-transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)检测方法,对该方法进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验,并分别采用该方法和实时荧光定量RT-PCR检测方法对72份猪淋巴结、肝脏等组织临床样品进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:建立的实时荧光RT-RAA方法在41℃条件下反应20 min即可完成检测,对PEDV的最低检测限为1×10~1拷贝/μL;且仅能检测出PEDV,与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRoV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV-4)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)均无交叉反应;相同拷贝浓度的质粒标准品3次重复的扩增曲线几乎重合,起峰时间与荧光值没有明显差异。对72份临床样品进行检测,该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。说明建立的实时荧光RT-RAA方法敏感性高,特异性和重复性良好,同时耗时短、操作简单,可用于PEDV的临床检测。

抗A型塞内卡病毒天然产物筛选及颉颃作用机制研究

【目的】从天然产物库中筛选具有颉颃A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)活性的天然产物并研究其颉颃作用机制。【方法】利用荧光素酶重组塞内卡病毒(rSVA-NLuc)与BHK-21细胞,结合荧光素酶高通量筛选技术,建立抗SVA药物体外筛选平台。从天然产物库中筛选浓度为10μmol/L时具有抑制荧光素酶活性效应的天然产物,并进一步利用实时荧光定量RT-PCR验证其抑制活性,通过细胞毒性试验确定其最大无毒浓度。选择病毒感染周期的吸附、入胞、复制、组装释放4个主要过程,利用实时荧光定量RT-PCR、50%组织细胞感染量(TCID 50)测定等进行天然产物分子颉颃机制研究。【结果】从包含560种天然产物的分子库中筛选出16种候选抗SVA活性分子,通过实时荧光定量RT-PCR及细胞毒性检测,鉴定出4种安全、有效的天然产物,分别为20S-原人参三醇((20S)-protopanaxatriol)、蕈青霉素(paxilline)、方胆碱(fangchinoline)、竹红菌乙素(hypocrellin B)。作用机制研究显示,20S-原人参三醇能抑制SVA感染过程中的吸附、复制阶段;蕈青霉素在SVA的吸附、入胞、复制、组装释放阶段即整个病毒感染周期均发挥抑制作用;方胆碱能抑制SVA的入胞、复制;竹红菌乙素能抑制SVA的吸附、入胞、复制及组装释放阶段。【结论】本试验从天然产物库中筛选出了4种具有抗SVA活性的天然产物,这些化合物抗病毒效果良好,且作用机制各有不同。本研究为抗SVA药物的进一步研发提供重要参考。

猪圆环病毒2型实时荧光RAA检测方法的建立及初步应用

根据猪圆环病毒2型(PCV2)Rep基因序列,设计引物及探针,建立了PCV2实时荧光重组酶介导等温扩增(recombinase-aid amplification, RAA)检测方法。该方法能在40℃恒温条件下20 min内对病原进行快速检测,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒3型和口蹄疫病毒均无交叉反应;对病毒核酸的最低检测限为21.2 copies/μL。用荧光PCR检测方法与建立的荧光RAA检测方法对66份临床样品进行检测,两种方法符合率为90.09%。结果表明,建立的PCV2实时荧光RAA方法适用于PCV2的快速检测。

2021年我国部分省份猪圆环病毒2型流行病学调查和基因分析

为了解2021年我国猪圆环病毒2型(PCV2)流行情况,本试验于7个地区16个省采集1685份组织样品,采用实时荧光定量PCR检测方法检测PCV2,对其中45份阳性样品进行全基因组序列扩增和遗传演化分析。结果显示,被检样品PCV2总阳性率为9.85%(166/1685),场总阳性率为32.71%(35/107);各地区样品阳性率介于4.29%~19.00%,东北地区样品阳性率最高;各地区场阳性率介于6.90%~60.00%,华中地区场阳性率最高。PCV2a、PCV2b和PCV2d亚型分离毒株占比分别为31.11%、4.44%和64.44%,其中PCV2d亚型为优势流行株,未发现PCV2e和PCV2c亚型。有24株PCV2分离毒株的Cap蛋白在C末端有1个赖氨酸(K)延伸,另有1株PCV2分离毒株的Cap蛋白在C末端有1个蛋氨酸(M)延伸。结果表明,2021年我国PCV2感染范围广,污染程度高,且正在不断发生遗传变异,需要持续跟踪监测PCV2的流行情况,以便及时制定有效的防控措施。

牛病毒性腹泻病毒TaqMan探针荧光RT-PCR方法的建立和临床应用

为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示:所建立方法能够特异性检测出BVDV-1,与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应;灵敏度高,最低检测下限为4.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925),序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a,BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法,监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型,为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。

猪源冠状病毒监测简报

目前,已知感染猪群的冠状病毒有6种,分别是猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)和猪δ冠状病毒(PDCoV)。在冠状病毒科α、β、γ、δ等4个属中,PEDV、TGEV、PRCV、SADS-CoV均为α冠状病毒,PHEV为β冠状病毒,PDCoV为δ冠状病毒。PRCV在临床上引发仔猪呼吸道症状,PHEV感染会造成仔猪呕吐和神经症状,其他4种病毒均可引起猪群腹泻。

一起猪繁殖与呼吸综合征与猪瘟混合感染的紧急流行病学调查

为探寻山东省某猪场暴发的仔猪腹泻、高热、呼吸困难等病症的原因,以及时控制并消除疫情,开展了紧急流行病学调查。对发病猪场进行现场调查、查看相关记录并进行临床诊断;采集病变组织样品,进行实验室检测;用Excel软件整理调查结果,并进行病因分析。结果表明,本次暴发系猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪瘟病毒混合感染所致,引种、购猪车带毒、断奶应激均可能是诱发此次疫情暴发的原因。针对调查结果提出的一系列防控措施建议,促使疫情最终得到控制。

三种伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测试剂盒的比较

为比较3种品牌(A、B、C)伪狂犬病病毒(PRV)g E抗体ELISA检测试剂盒的临床使用效果,应用中和试验来标定伪狂犬病非免疫猪场的180份临床血清样品,同时用3种试剂盒进行检测,并对试剂盒的重复性、敏感性、特异性以及与中和试验结果的符合度等指标进行测定与分析。结果显示:3种试剂盒的批内稳定性均较好,变异系数均小于10%;批间重复性差异较大,变异系数最小者为8.09%,最大者高达21.31%;3种试剂盒的诊断特性良好,敏感性为95.56%~97.78%,特异性为94.44%~100%;各试剂盒检测结果与中和试验结果均完全相符(Kappa值为0.91~0.96)。比较结果表明,3种试剂盒均适用于临床样品的PRV g E抗体检测,其中稳定性及敏感性俱佳的试剂盒C更适用于PRV的持续监测、早期发现、引种检疫及净化效果评估,而特异性与准确性最高的试剂盒B更适用于贵重病畜的诊断淘汰。因此,生产实践中应根据诊断目的合理选择最适试剂盒。

一起猪蓝耳病与伪狂犬病混合感染的紧急流行病学调查

2017年11月4日起,山东省某猪场部分育肥猪出现咳嗽、气喘、发烧等症状,发病6~7 d后死亡。随后,个别母猪发生流产,哺乳仔猪、保育猪接连出现呼吸道症状并死亡。为探寻可能的发病原因,以便及时提出并采取行之有效的防控措施,开展了紧急流行病学调查。通过现场调查、临床诊断与实验室检测,确定本次疫情系猪蓝耳病病毒与伪狂犬病病毒混合感染所致。调查发现:邻场发病、人员传播、寒冷应激、断奶应激均可能是诱发此次疫情的原因。针对此次疫情,提出全群紧急免疫伪狂犬病疫苗,并配合使用长效土霉素与抗生素进行治疗等建议。养殖户采纳了建议并采取了相应措施,最终疫情得到有效控制。

我国猪群疫病流行动态分析

通过流行病学调查与实验室检测分析,认为2016年我国猪群疫病总体平稳,流行强度保持着连续四年持续下降的态势。临床常见疫病有8种,主要疫病群流行率呈下降趋势;不同区域以及不同规模养殖场的疫病流行状况存在一定差异;临床健康猪群带毒率虽持续下降,但仍然偏高。结合以往调查监测数据与疫病的流行病学特点,提出2017年我国猪群疫病流行动态预警。

2017年我国猪群疫病流行状况及2018年流行动态分析

2017年,对全国29个省份、4 893个规模化猪场进行猪群疫病的流行病学调查,并从部分猪场采集具有临床意义的样品进行实验室检测与分子流行病学监测。结合工作实际,对2017年猪群疫病流行状况进行阐述分析,并结合历年调查、监测数据与疫病的流行病学特点,对2018年疫病流行态势进行预警,以期为把握疫病形势并作好相关防控工作提供一定参考。

2012年我国部分省市规模化猪场副猪嗜血杆菌分离鉴定及菌株血清分型

为掌握2012年我国猪场副猪嗜血杆菌(Hps)感染的发病状况,在我国部分省市规模化猪场采集疑似副猪嗜血杆菌病猪的心包积液及发生纤维素性浆膜炎的肺脏等病料共168份,通过病原分离培养、形态及培养特性观察、生化试验、PCR扩增等方法进行鉴定,最终分离出51株副猪嗜血杆菌,分离率约为30.4%。对51株副猪嗜血杆菌用琼脂扩散法进行血清分型,得到4型的6株(11.8%),5型的9株(17.6%),13型9株(17.6%),12型、14型各2株,1型、6型、10型、11型各1株,未能确定血清型19株,4型、5型、13型占总比例的47.1%,占有毒力血清型(强毒和中等毒力血清型)比例80.0%,表明副猪嗜血杆菌4型、5型、13型菌株是我国的优势血清型。

塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检测方法的建立

为建立塞尼卡谷病毒(SVV)重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法,本研究针对SVV 3D基因设计了引物和探针,通过反应条件优化、特异性、灵敏性和重复性试验,建立了SVV RPA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,该方法与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒无交叉反应;在40℃、20 min内可检测的最低浓度为56拷贝/μL质粒标准品;通过3次重复试验检测,LFD检测线灰度值变异系数范围在4.49%~9.73%。利用该方法对120份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究首次建立了检测SVV的等温、快速RPA-LFD方法,读取结果不依赖任何仪器设备,为猪群感染SVV的现场快速诊断、流行病学研究和根除方案的制定提供帮助。

添加乳酸菌人工饲喂幼鸽效果研究

找出母鸽自然喂养和人工饲料喂养效果的差异，探索人工饲喂乳鸽的科学方法，提高乳鸽的生长速度和成活率。将3日龄的乳鸽随机分为4组，A组和D组分别为自然喂养组和常规饲养对照组，B组和C组为分别添加5×10^7个／mL和2．5×10^7个／mL乳酸菌的饲喂组。饲喂周期为15d，第1-6d时，每天喂8次，以注射器灌喂；第7—15天时，每天喂5次，以糊状物或泥巴样物投喂。观察并统计幼鸽的生长速度及成活率。结果表明自然喂养效果优于人工饲喂，用添加乳酸菌的饲料人工喂养效果（B组平均体重349．86g，成活率70％、C组平均体重304．86g，成活率60％）虽低于自然喂养的水平（A组平均体重448．00g，成活率96％），但优于不含乳酸菌的饲料的饲喂效果（D组平均体重277．67g，成活率60％），表明乳酸菌对促进乳鸽的正常发育具有一定作用，且浓度越大效果越明显。该研究结果为人工饲喂乳鸽提供了科学依据。

猪流行性腹泻病毒流行毒株的致病性研究

为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株感染动物的致病性和组织显微变化,试验用分离的3株PEDV流行毒株接种不同日龄仔猪,记录接毒后仔猪的临床症状和死亡时间,采集肝脏、肾脏、胃、小肠、空肠等不同组织器官,观察病理组织学变化。结果表明:PEDV流行毒株对仔猪的致病性极强,9日龄之前的仔猪接毒后均出现腹泻症状和死亡,新生仔猪接毒的致死时间最短,平均为26.8 h;随着仔猪日龄的增加,对仔猪的致病性降低,致死时间也随之延长,12日龄仔猪接毒后出现腹泻症状但不死亡。接毒后组织病理学变化除了肠道的肠绒毛萎缩、变短、断裂外,还可见胃、肝脏、肺脏、肾脏等组织的弥漫性出血。说明PEDV流行毒株感染可引起仔猪发病死亡,组织显微变化以肠道绒毛病变和胃等器官的出血为特征。

2016——2018年我国部分猪群塞尼卡病毒回顾性监测

塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)是最近新出现的可引起猪水泡样病变的单股小RNA病毒。为了解SVA的流行状况,采集对2016—2018年从我国辽宁等省份猪群的164份病料和2018年从我国福建等7省份35个屠宰场的458份组织混合样品和95份血清样品,用荧光实时定量RT-PCR方法进行SVA检测和分析。结果显示:在2016年的48份样品中,从3个省份检测出7份阳性样品,阳性率为14.6%。2017年的32份病料中,从5个省份检测出7份阳性样品,占比为21.9%;2018年的84份病料中,从3个省份检测出19份阳性样品,占比为22.6%。屠宰场组织样品中,从6个省份检出55份SVA阳性样品,阳性率为12.0%;血清样品中,从1个省份检出7份阳性样品,阳性率为7.4%。结果表明,我国猪群SVA感染年份至少可追溯到2016年;SVA在我国流行面相对较广,且猪群中存在隐性带毒,因此须重视猪群的SVA监视和监测。

我国猪圆环病毒病的流行病学分析

为明晰猪圆环病毒病在我国猪群中的流行现状,结合近年来的论文,回顾了我国猪圆环病毒病的流行史,整理了我国猪圆环病毒病的血清学和病原学调查和监测情况,提出了我国猪圆环病毒病具有感染率高、流行面广,表观健康猪群带毒率较高,感染率稳步上升以及经常与其他多病原共同感染的流行特点;分子流行病学分析结果显示,我国猪圆环病毒2型流行毒株的基因组相对保守,流行的毒株类型逐渐从基因型2a转向2b,并已出现基因型2d的流行以及不同基因型之间经常发生基因重组等特性,据此本文提出了猪圆环病毒病的防控方向。