4种植物源性成分多重real-time PCR检测方法的建立及其在食用淀粉中的应用

建立一种可同时快速检测红薯、木薯、马铃薯、玉米源性成分的多重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。分别以红薯g3pdh基因、木薯g3pdh基因、马铃薯UGPase基因、玉米zSSIIb基因为靶基因设计特异性引物和TaqMan探针,以18S rRNA基因为内参基因,建立多重real-time PCR方法,开展方法学验证,并对不同掺入比例模拟样品和实际淀粉样品进行检测。结果显示,该方法具有高通量、特异性强、灵敏度高等优点。与15种非目标源性均无交叉反应;对目标DNA的检测灵敏度可达到3×10^(-3) ng/μL,且具有良好的线性关系和扩增效率;对淀粉样品的检出限可达0.1%,对50份实际样品进行检测,结果与参比方法一致,说明建立的多重real-time PCR法可用于食用淀粉种类掺假鉴别检测。

肉制品中马源性成分重组酶介导链置换等温扩增实时检测方法的建立及应用

目的:建立一种快速鉴定肉及肉制品中马源性成分的重组酶介导链置换等温扩增实时检测方法。方法:以马源性ATpase 6基因为靶基因设计多组特异性引物和Exo探针,通过引物筛选及反应参数优化,建立一种采用重组酶介导链置换等温扩增技术检测马源性成分的方法,并对该方法进行特异性、灵敏度和稳定性验证,同时通过对不同掺入比例混合样品、不同加工工艺模拟样品和市售样品进行检测,分析方法的检出限、适用性和准确性。结果:该方法反应迅速、特异性强、灵敏度高。可在39℃恒温条件下16min内完成反应;对23种非目标源性具有良好特异性;目标DNA的检测灵敏度可达到1.8copies/μL水平;对生肉的检出限为0.01%(质量分数,下同),对熟肉制品的检出限为0.1%;对90份市售样品进行检测,结果与标准方法一致。结论:建立的重组酶介导链置换等温扩增方法可用于肉及肉制品中马源性成分的掺假鉴别检测。

3种致病菌多重real-time PCR检测方法的建立及其在散装即食肉制品中的应用

建立一种同时快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的三重实时聚合酶链式反应(realtime polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。以沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌Sa442基因和蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因为靶基因设计引物和TaqMan探针,建立多重real-time PCR方法,对该方法进行方法学验证,并对实际的散装即食肉制品样品进行检测。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。对15株非目标菌进行检测,结果均为阴性;3种致病菌的定量线性浓度范围为10^(2)~10^(8) CFU/mL,且定量检测批内和批间的变异系数均小于2%;沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌在未增菌的即食肉制品样品中检出限分别为3.8×10^(2)、4.9×10^(2) CFU/mL和5.7×10^(2) CFU/mL,经增菌5 h后,检出限提高到3.8、4.9 CFU/mL和5.7 CFU/mL。对100份实际样品进行检测,结果与标准方法一致,说明建立的多重real-time PCR法可以用于散装即食肉制品中3种致病菌的检测。

基于数据挖掘建立北京地区牛、羊肉串掺假风险预测模型

通过对2019年北京地区销售的牛、羊肉串掺假情况进行调查,建立基于数据挖掘的食品安全风险预测模型。本实验从10种不同销售渠道的100家销售单位采集牛、羊肉串样品200份,采用实时聚合酶链式反应法对样品进行猪、牛、羊、鸡、鸭5种源性成分检测,分析掺假情况,并基于检测指标及样品信息,运用反向传播(back propagation,BP)神经网络算法构建牛、羊肉串掺假的风险预测模型。结果表明:由质控样品获得的源性成分报出限为Ct值28.0,在此基础上本次调查的200份样品,总不合格率为17.5%(35/200),其中牛肉串样品不合格率为14%(14/100),羊肉串样品不合格率为21%(21/100),用猪肉和鸭肉进行肉类掺假是目前主要的掺假手段;利用上述调查数据,经数据准备、模型生成、数据训练和验证及参数优化,构建的3层BP神经网络预测模型对于不合格样本的预测准确率达95.7%,可满足风险预测的目的。该模型具有良好的参考和应用价值,可为食品安全风险预防和控制提供依据。

4种动物源性成分多重real-time PCR检测方法的建立及其在驴肉制品检测中的应用

建立一种同时快速检测驴、马、猪及鸭源性成分的四重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。分别以4种源性成分的Nad5、ATpase6、ATP8、cytb基因为靶基因设计特异性引物和TaqMan探针,以18S rRNA基因为内参基因,建立多重real-time PCR方法,并对该方法进行方法学验证,同时对不同掺入比例模拟样品、不同加工工艺模拟样品和实际驴肉样品进行检测。结果显示,该方法具有高通量、特异性强、灵敏度高等优点。当Ct值≤35.0时,方法对16种非目标源性具有良好特异性;灵敏度可检测到质量浓度为2×10^(-4)ng/μL的模板DNA;对生肉的检出限为肉含量的0.001%,对熟肉制品的检出限为肉含量的0.01%;对100份实际样品进行检测,结果与标准方法一致,说明建立的多重real-time PCR法可用于肉及肉制品中常见掺假源性成分的检测。

1株产细菌素植物乳杆菌的筛选及其细菌素抑菌性质研究

从广西巴马地区取样的米粉中共分离出31株乳酸菌，以单核细胞增生李斯特菌为指示菌，采用牛津杯平板扩散法检测抑菌物质，筛选得到1株产细菌素的乳酸菌M23。通过微生物形态学与16SrRNA基因序列分析，鉴定该菌株为植物乳杆菌。植物乳杆菌M23代谢产生的乳酸菌细菌素在pH2．0～10．O范围内具有良好的抑菌活性，121℃处理15min的条件下依然具有抑菌活性，表明其具有良好的酸碱稳定性和热稳定性。发酵试验表明，该乳酸菌素的最佳收获时间为乳酸菌培养14h。抑菌谱试验表明，该乳酸菌素能够有效抑制部分食源性革兰氏阳性、阴性致病菌。

瑞士乳杆菌M14-1所产细菌素的分离纯化及抑菌特性分析

瑞士乳杆菌M14-1发酵上清液经硫酸盐沉淀后得到粗蛋白提取物,再经离子交换、C18固相萃取进行进一步纯化后得到高纯度的纯化产物。研究细菌素M14-1酶敏感性、酸碱稳定性、热稳定性、抑菌谱以及细菌素产量与菌株生长关系。研究发现细菌素M14-1对蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶敏感,对过氧化氢酶不敏感。该细菌素热稳定性较差,121℃处理15 min后,活性下降。细菌素M14-1在pH2.0~10.0内具有抑菌活性。抑菌谱结果表明细菌素M14-1抑菌谱较窄,仅对单增李斯特氏菌有较好的抑制效果。瑞士乳杆菌M14-1在发酵16h后达到稳定期,而细菌素M14-1最佳收获时间为瑞士乳杆菌M14-1发酵12 h后。

金银花和蒲公英提取物对肉源性假单胞菌生物被膜的清除作用

为明确金银花和蒲公英提取物对假单胞菌生物被膜的清除效果,采用单因素实验确定假单胞菌生物被膜的最佳培养温度、培养时间和固定方法;在此条件下,采用结晶紫法结合扫描电镜研究金银花和蒲公英提取物在不同质量浓度、不同添加时间下对肉源性假单胞菌生物被膜的清除作用。结果表明,30℃培养24 h生物被膜测定值最高。提取物对生物被膜的清除效果随质量浓度的增加而逐渐增强(P<0.05),在生物被膜形成0 h加入的清除效果显著强于在24 h加入的清除效果(P<0.05)。当提取物浓度高于最小抑菌浓度(MIC)时,主要通过抑制菌体生长而清除生物被膜;当低于最小抑菌浓度时,主要通过破坏生物被膜立体结构而清除生物被膜。提取物破坏假单胞菌生物被膜结构,使生物被膜形成孔洞,从而清除生物被膜。本研究证明金银花和蒲公英提取物能够清除假单胞菌生物被膜,对肉的保鲜具有潜在应用价值。

基于网络数据的预先包装熟肉制品生产过程致病菌监控指标选择分析研究进展

主要研究预先包装熟肉制品生产过程中主要食源性致病菌污染风险来源和变化趋势。以GB 29921—2021《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》中肉制品涉及的沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和致泻大肠埃希氏菌为研究对象,基于网络数据统计畜禽肉原料、生产过程环境和过程产品以及市售产品中这4种致病菌污染监测结果,通过对比在产销过程不同阶段的检出情况,分析污染风险的变化趋势,为企业在生产过程中合理选择和开展致病菌监控提供建议。结果表明:畜禽肉原料中4种致病菌污染较普遍,总检出率达到10.63%;生产过程中,单核细胞增生李斯特菌在生产环境中检出率为7.25%,沙门氏菌检出率为2.65%,金黄色葡萄球菌检出率为1.07%,通过熟制工艺和生产过程卫生控制措施,金黄色葡萄球菌和沙门氏菌检出率下降趋势明显大于单核细胞增生李斯特菌,结合单核细胞增生李斯特菌嗜冷、易形成生物膜且具有较高致病风险的生物学特性,建议企业重点关注该致病菌在生产过程中的污染风险,并将其列为致病菌监控指标。需要说明的是,因为致泻大肠埃希氏菌为新版GB 29921新增加的限量指标,所以污染监测数据少于其他3种致病菌,后续应针对该致病菌加强监测力度。

Rosa26-LEM4定点转基因小鼠模型构建

为研究LEM4基因在肿瘤发生发展中的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术,在小鼠基因组的Rosa26位点插入CAG-lox P-STOP-lox P-h LEM4-3×FLAG-IRES-EGFP,建立了Rosa26-LEM4定点转基因小鼠模型.依据小鼠Rosa26位点序列设计合成g RNA、构建含同源序列和目的序列CAG-lox P-STOP-lox P-h LEM4-3×FLAG-IRES-EGFP的插入序列,和Cas9核酸酶m RNA共同注射入小鼠的受精卵中并获得敲入小鼠后代,经Southern blot鉴定、以及PCR扩增插入序列后的序列分析鉴定出F_(0)首建鼠,F_(0)首建鼠与野生型小鼠杂交后获得基因型为Rosa26-LEM4^(flox-LSL/wt)的F_(1)代小鼠.Rosa26-LEM4^(flox-LSL/wt)小鼠自交后获得Rosa26-LEM4^(flox-LSL/flox-LSL)基因型小鼠.Rosa26-LEM4^(flox-LSL/flox-LSL)小鼠与EIIa-cre工具鼠杂交后获得表达人LEM4蛋白的Cre^(+/-);Rosa26-LEM4^(flox-LSL/wt)小鼠模型.该模型的建立为研究LEM4的肿瘤生物学功能提供了材料和思路.