2型转谷氨酰胺酶对人胶质母细胞瘤细胞U251放射敏感性的影响

为探讨2型转谷氨酰胺酶(transglutaminase 2,TG2)对胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)放射敏感性的影响。通过生信分析TG2表达与胶质瘤病人预后的关系,并分析了其在GBM放射抵抗细胞株U251中的水平;瞬时转染得到TG2过表达细胞(U251-TG2)或空载细胞(U251-EV);CCK8法绘制生长曲线;transwell检测细胞迁移能力;不同剂量X射线照射后,检测细胞克隆形成能力、ROS水平;并通过免疫荧光检测γ-H2AX水平;Western blot检测自噬关键分子Beclin-1、LC3及mTOR磷酸化水平。结果显示,TG2高表达胶质瘤患者具有更差的无进展间隔期及总生存期,TG2在放射抵抗型U251中的表达显著高于野生型U251;U251-TG2细胞增殖能力高于U251-EV,且前者迁移能力高于后者;经X射线照射后,U251-TG2细胞克隆形成率高于U251-EV,前者ROS水平及γ-H2AX荧光焦点数均低于后者;自噬关键蛋白Beclin-1及自噬活性指标LC3-Ⅱ/Ⅰ比值在U251-TG2的水平均高于U251-EV,且前者mTOR磷酸化水平低于后者。实验结果证明,X射线照射后,TG2可能通过抑制mTOR磷酸化的方式促进自噬,进而降低GBM细胞U251的放射敏感性。

骨肉瘤程序性死亡因子配体1的表达及临床意义

目的通过检测程序性死亡因子配体1(PD-L1)在骨肉瘤组织中的表达,探讨其与骨肉瘤患者临床特征及预后的相关性。方法选取2006年1月至2012年12月,福建医科大学附属第一医院初诊为骨肉瘤并接受手术切除术的72例患者为研究对象,收集经病理确诊的患者骨肉瘤石蜡标本,采用免疫组织化学(IHC)方法检测组织中PD-L1的表达,以PD-L1肿瘤细胞表达超过5%为阳性。同时收集患者的临床资料,进行统计学分析。结果在72例骨肉瘤组织样本中,22例(30.6%)呈PD-L1阳性。PD-L1的表达与患者年龄、性别、肿瘤位置以及肿瘤大小无相关性(P均>0.05)。单因素分析结果表明,患者的年龄、性别、肿瘤位置和肿瘤大小均与无进展生存(PFS)和总生存(OS)中位时间无关(P均>0.05);接受新辅助化疗患者的PFS中位时间(68.0个月,95%CI33.8~102.2个月)和OS中位时间(68.0个月,95%CI 34.6~101.4个月)均长于未接受新辅助化疗患者(22.0个月,95%CI 16.8~27.2个月;30.0个月,95%CI 20.6~39.4个月)(P均<0.05);PD-L1阳性骨肉瘤患者PFS中位时间(10.0个月,95%CI0.0~20.7个月)和OS中位时间(28.0个月,95%CI 11.1~45.0个月)均短于PD-L1阴性患者(44.0个月,95%CI21.0~67.0个月;52.0个月,95%CI31.4~72.6个月)(P均<0.05)。多因素分析结果显示:肿瘤大小是骨肉瘤患者PFS期的独立影响因子(P<0.05);是否接受新辅助化疗以及肿瘤是否为PD-L1阳性均是骨肉瘤患者PFS期和OS期的独立影响因子(P均<0.05)。结论骨肉瘤患者中部分肿瘤呈PD-L1阳性,是否接受新辅助化疗以及PD-L1是否阳性均是骨肉瘤患者预后不良的独立影响因子。阻断程序性死亡因子(PD-1)/PD-L1的免疫疗法可能是PD-L1阳性骨肉瘤患者可选择的新型治疗方式。

甘草次酸减轻放射性炎症反应的作用机制研究

目的:探讨甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)减轻放射性炎症的作用机制。方法:以4Gy X线照射小鼠巨噬细胞RAW264.7为辐射诱导炎症的细胞模型,采用ELISA法检测细胞上清液中的促炎症因子水平,RT-PCR法检测促炎症因子的mRNA表达水平,cell-based ELISA法检测细胞内磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)蛋白表达,凝胶电泳迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测活化蛋白-1(AP-1)的DNA结合活性,荧光酶标仪检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生,细胞色素C还原法检测细胞内尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶的活性。结果:甘草次酸通过抑制X线照射后RAW264.7细胞内促炎症因子IL-6、IL-1β的mRNA表达而降低其分泌。甘草次酸抑制p38MAPK磷酸化及下游转录因子AP-1的DNA结合活性。并通过抑制X线照射后RAW264.7细胞内NADPH氧化酶活性而减少ROS的产生。结论:甘草次酸可能通过抑制NADPH氧化酶/ROS/p38MAPK信号通路而抑制电离辐射诱导的炎症反应。

甘草次酸干预对X射线照射后小胶质细胞生物学行为的影响

目的通过甘草次酸(GA)干预X线照射后的小胶质细胞,探究GA对小胶质细胞生物学行为的影响及其机制。方法体外培养小胶质细胞BV2细胞系,分别给予细胞不同的干预措施:甘草次酸1μg/mL+射线照射(GA 1μg/mL+IR组)、甘草次酸10μg/mL+射线照射(GA 10μg/mL+IR组)、空白对照+射线照射(Cont+IR组)、溶剂对照组+射线照射(DMSO+IR组)、地塞米松10 nmol/L+射线照射(Dex10nmol/L+IR组)。照射方法:药物预处理3 h后,以6 MV X射线单次剂量4 GY照射BV2细胞,6 h后检测BV2细胞的ROS含量、IL-1β分泌情况及细胞中Caspase-1、HO-1的表达的变化情况。结果CCK8实验结果显示,BV2细胞经不同浓度GA干预后,GA浓度为10μg/mL时细胞存活率最高达73.876%,1μg/mL时次高为67.226%。流式细胞术结果显示,4 Gy照射后,GA组(1μg/mL)的ROS值较DMSO组明显上调(14.567%vs 7.167%,P=0.025),而与Dex(10 nM)组相比(14.567%vs 12.900%,P=0.995)未见明显改变。ELISA检测结果表明,GA+IR组(GA 10μg/mL组)IL-1β的水平为照射后4组中最低值(0.156),但与Cont+IR组(0.156 vs 0.212,P=0.131)、DMSO+IR组(0.156 vs 0.176,P=0.999)、Dex(10 nM)组(0.156 vs 0.184,P=0.961)相比差异无统计学意义。Western blot检测结果显示GA+IR组的Caspase-1相对蛋白水平较Cont+IR组(0.147 vs 0.243,P=0.000)、DMSO+IR组(0.147 vs 0.590,P=0.000)、Dex+IR组(0.147 vs 0.565,P=0.000)均明显下调,而GA+IR组HO-1相对蛋白水平(0.537)较其他照射组呈上调趋势(P=0.000)。结论GA下调小胶质细胞接受X线照射后Caspase-1蛋白的表达,上调HO-1蛋白水平,表明GA能够抑制细胞凋亡,增加脑内小胶质细胞的抗氧化能力。GA可能在放射性脑损伤过程具有一定的神经保护作用,为临床治疗放射性脑损伤提供可能的治疗机制。

人血浆Nav1.5通道蛋白ELISA检测方法的建立

目的建立一种高效特异、灵敏度高的ELISA方法检测人血浆Nav1.5(心脏电压门控性钠通道)通道蛋白。方法设计并合成Nav1.5蛋白质的部分肽链作抗原免疫新西兰大耳白兔,制备抗体。经亲和层析提取纯化并生物素化,分别作为包被或检测抗体使用。建立检测人血浆Nav1.5通道蛋白的ELISA方法并优化条件。结果获得抗人血浆Nav1.5通道蛋白的抗体,并成功建立ELISA检测人血浆Nav1.5通道蛋白的方法。用该方法检测Brugada 1型患者血浆中Nav1.5钠通道蛋白的表达水平,与正常人的比较差异显著。结论建立高效特异检测人血浆Nav1.5通道蛋白的ELISA方法,为临床研究Nav1.5通道蛋白提供一个可行的方案。

B10细胞在放射性肺纤维化进程中的动态变化

目的:探究B10细胞放射性肺纤维化进程中的动态变化。方法:将30只6-8周C57BL/6小鼠随机分为未照射对照组、照射后2 d组(IR2d组)、照射后14 d组(IR14d组)、照射后3个月组(IR3m组)、照射后5个月组(IR5m组),应用电离辐射建立放射性肺纤维化的动物模型,通过HE染色法、Masson染色观察肺组织的病理变化,免疫荧光染色法观察α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达,流式细胞术检测B10细胞在肺、脾脏中的数目变化。结果:胸部照射后早期小鼠肺组织呈现炎性反应;照射后3个月出现肺泡结构破坏,间质填充,照射后5个月大量胶原填充,α-SMA表达较对照组明显增加。IR2d组、IR14d组肺组织中的B10细胞比例较对照组明显增加,而IR3m组B10细胞较IR2d组明显下降;照射后2 d脾脏中B10细胞开始增加,照射后14 d达到峰值,照射后3个月较照射后2 d、14 d明显下降。结论:放射性肺纤维化进程中存在B10细胞浸润,呈现早期升高晚期降低的趋势。

线粒体肌酸激酶1对人鼻咽癌细胞株CNE－1顺铂敏感性的作用研究

目的探讨线粒体肌酸激酶1（ubiquitous mitochondrial creatine kinase，CKMT1）在人鼻咽癌细胞株CNE－1对顺铂（cisplatin，DDP）敏感性中的影响。 方法瞬转CNE－1得CKMT1过表达细胞或空载体细胞（EV），MTT法绘制生长曲线、计算DDP IC50，不同浓度DDP处理下平板克隆形成实验，流式细胞术检测细胞周期与凋亡，Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax/Bcl－2/C－PARP及转录因子p－STAT3－Tyr705水平。采用GraphpadPad Prism5软件进行统计学处理。 结果CKMT1和空载体细胞的转染效率均达90%以上；前者的增殖速度高于后者；但前者DDP IC50为2.76 μmol/L，显著低于后者的4.60 μmol/L（t＝6.91，P〈0.01），且在一定浓度DDP作用下前者的克隆形成率较低；细胞周期在G2/M期阻滞更明显。DDP浓度为2 μmol/L时，CKMT1凋亡率（18.33±0.67）%显著高于EV（11.80±0.70）%（t＝6.75，P〈0.01）；CKMT1的促凋亡蛋白C－PARP和Bax显著高于EV（t＝72.63，P〈0.01；t＝4.22，P〈0.05），而凋亡抑制蛋白Bcl－2在CKMT1中的表达显著低于EV（t＝49.08，P〈0.01）；且p－STAT3－Tyr705水平也更低（t＝221.60，P〈0.01）。结论DDP作用下，CKMT1可能通过一定的机制抑制STAT3的活化，进而提高CNE－1对DDP的敏感性。

MCT1和LDHB在荷乳腺癌小鼠髓系抑制性细胞中的表达及意义

目的比较正常小鼠和荷乳腺癌小鼠骨髓中髓系抑制性细胞(MDSCs)的含量,探讨其产生免疫抑制功能的可能机制。方法建立荷乳腺癌小鼠模型,利用BD FACSAriaⅢ流式分选仪分选正常小鼠组和荷乳腺癌小鼠组骨髓中的MDSCs(CD11b+Gr-1+),比较其含量;q-PCR法检测两组MDSCs中MCT1及LDHB的mRNA水平。结果荷乳腺癌小鼠骨髓中MDSCs的比例为(48.92±3.13)%高于正常小鼠(25.13±1.95)%,差异有统计学意义(P<0.001);荷乳腺癌小鼠MDSCs中MCT1的mRNA相对表达量(0.010±0.005)为正常小鼠(0.003±0.001)的3.33倍,差异有统计学意义(P<0.05);荷乳腺癌小鼠MDSCs中LDHB的mRNA相对表达量(0.008±0.002)为正常小鼠(0.004±0.001)的2.00倍,差异极显著(P<0.01)。结论 MDSCs在荷乳腺癌小鼠骨髓中的比例显著高于正常小鼠,其能量代谢关键分子MCT1、LDHB的表达也显著高于正常小鼠。MDSCs的能量代谢特点可能正是其发挥免疫抑制功能的重要基础。

miR-223通过抑制NLRP3防护小鼠急性放射性肺损伤

目的研究miR-223通过抑制NLRP3对小鼠急性放射性肺损伤的防护。方法将40只雌性C57BL/6 J小鼠,按随机数表法将小鼠分成4个组:健康对照组、单纯照射组、照射+miR-223组和照射+阴性对照(NC)组,每组10只。其中3个照射组给予15 Gy X射线全肺单次照射,照射+miR-223组和照射+NC组自照射前1 d开始至照射后14 d,隔天尾静脉注射10 nmol miR-223 agomir或agomir-NC。照射后第14 d取肺组织标本,HE染色观察病理变化,免疫组织化学法观察IL-1β和IL-18的定位和表达,实时荧光定量PCR检测miR-223和NLRP3的表达,Western blot检测NLRP3和Caspase-1的表达,ELISA检测肺组织中IL-1β和IL-18的表达。结果辐射导致小鼠肺组织内miR-223表达下降和NLRP3的表达升高,给予miR-223 agomir可以抑制NLRP3的升高,同时减轻肺部炎症。实验结果显示,与单纯照射组相比,miR-223可以减轻小鼠肺组织的急性炎症反应。使得肺组织中IL-1β和IL-18表达下降(t=10.16、6.00,P<0.05)。肺组织NLRP3 mRNA表达下降(t=3.22,P<0.05)。Western blot结果显示,与单纯照射组相比,照射+miR-223组的NLRP3,Caspase-1蛋白表达下降(t=12.47、4.95,P<0.05)。Elisa结果也表明,在照射+miR-223组中炎症因子IL-1β和IL-18表达下降(t=8.22、8.47,P<0.05)。结论miR-223通过抑制NLRP3的表达,抑制炎症因子IL-1β和IL-18的分泌,减轻炎症反应,对急性放射性肺损伤具有保护作用。

TAT—LHRH修饰的壳聚糖／DNA纳米粒的细胞内吞途径

目的探索对肝癌细胞HepG2具有较高转染效率和靶向性的TAT-LHRH修饰的壳聚糖／DNA纳米粒的内吞途径。方法采用复凝集法，将荧光标记的质粒DNA与壳聚糖或TAT—LHRH修饰的壳聚糖混合制备壳聚糖／DNA纳米粒（CDN）和TAT—LHRH修饰的壳聚糖／DNA纳米粒（TLCDN）。观察3种内吞途径抑制剂Chlorpromazine、Filipin或Dynasore对HepG2细胞摄入CDN或TLCDN的影响，用高内涵采集数据并分析。结果Chlorpromazine对CDN摄人的抑制作用高于对TLCDN摄人的抑制作用，但其差异无统计学意义；Filipin明显抑制HepG2对TLCDN的摄人，但对CDN的摄入则起促进作用；Dynasore能同时抑制HepG2对上述2种纳米粒的摄入，且程度基本相同。结论肝癌细胞HepG2对CDN的摄入主要通过网格蛋白依赖性细胞内吞途径，而对TLCDN的摄入途径包含网格蛋白依赖性细胞内吞途径和小窝蛋白介导的细胞内吞途径，但以后者为主。

血浆游离DNA定量检测对炎症性肠病活动性评估的价值

目的探讨血浆游离DNA对IBD活动度评估的价值。方法选取2014年7月至2017年6月福建医科大学附属第一医院收治的145例IBD患者，采用PicoGreen荧光比色法定量检测患者的血浆游离DNA含量，以同期37名体格检查者为健康对照组，分析IBD患者的游离DNA含量与CRP、ESR和IBD活动度的相关性。以ROC曲线评估游离DNA含量对IBD活动度的诊断效能，组间比较采用两独立样本t检验，Pearson相关系数分析两变量的相关性。结果CD和UC患者的游离DNA含量分别为（29.17±2.07） μg/L和（26.86±1.97） μg/L，均高于健康对照组的（21.10±1.02） μg/L，差异均有统计学意义（t＝2.609、2.082，P均〈0.05）。活动期CD、UC患者的血浆游离DNA含量分别为（35.72±3.26）、（32.37±3.42） μg/L，均分别高于缓解期CD、UC患者的（21.12±1.43）、（20.82±1.02） μg/L，差异均有统计学意义（t＝3.806、3.116，P均〈0.01）。CD患者游离DNA与CRP、ESR、疾病活动度均呈正相关（r＝0.555、0.393、0.400，P均〈0.01），UC患者游离DNA与CRP、ESR、疾病活动度均呈正相关（r＝0.640、0.421、0.360，P均〈0.01）。CRP联合ESR诊断CD的效能最高，AUC值为0.841，灵敏度和特异度分别为81.4%和74.3%；游离DNA、CRP、ESR联合诊断UC的效能最高，AUC值为0.851，灵敏度和特异度分别为74.3%和96.9%。结论IBD患者游离DNA含量升高与IBD炎性活动有一定关联，检测游离DNA有助于识别活动期IBD，联合ESR和CRP检测可提高对UC的识别效率。

血浆游离DNA完整性检测对炎症性肠病患者结直肠癌变筛查的价值

目的 评估外周血游离DNA(cfDNA)的完整性(cfDI)检测对炎症性肠病(IBD)患者结直肠癌变筛查的价值.方法 采用实时定量PCR法检测78例克罗恩病(CD)、67例溃疡性结肠炎(UC)、40例结直肠癌(CRC)患者及37例健康志愿者的血浆Alu115cfDNA和AIu247cfDNA含量,计算cfDI(Alu247/Alu 115 cfDNA比值).比较活动期CD(ACD)、缓解期CD(RCD)、活动期UC(AUC)、缓解期UC(RUC)、CRC患者和健康志愿者的外周血cfDNA含量和cfDI.采用ROC曲线分析血浆cfDI对结直肠癌的诊断效能.结果 CRC组的cfDI为0.317 (0.246,0.370),显著高于健康对照组的0.265(0.203,0.334) (P=0.017)、ACD组的0.260(0.251,0.277) (P=0.005)、AUC组的0.267(0.191,0.316)(P=0.017)、RCD组的0.254(0.235,0.278) (P=0.005)和RUC组的0.278(0.236,0.309)(P=0.041),差异均有统计学意义,而其他各组间cfDI差异均无统计学意义.ROC曲线分析显示,cfDI在其相应临界值时,CRC组区分健康对照组、ACD组、RCD组、AUC组、RUC组的ROC曲线下面积分别为0.643、0.692、0.674、0.650和0.665,P值分别为0.031、0.003、0.010、0.025和0.017.结论 外周血cfDI有助于IBD与CRC的鉴别诊断,可能成为IBD患者结直肠癌变监测的潜在生物学指标.

MCT1在鼻咽癌病人外周血MDSC中的表达及意义

目的检测单羧酸转运体1(MCT1)在鼻咽癌病人和正常人外周血髓系抑制性细胞(MDSC)中的表达并探讨其临床意义。方法随机收集经病理确诊的鼻咽癌病人和正常人外周血各10例,红细胞裂解液处理后,采用BD FACSAriaⅢ流式细胞仪分选出MDSC(CD11b^+CD33^+HLA-DR^-),q-PCR检测比较两组MCT1 mRNA水平的差异。结果鼻咽癌病人外周血中MDSC的比例(19.77±4.77)%显著高于正常人(0.84±0.18)%,P<0.001;且前者MCT1 mRNA水平(4.05±0.56)为后者(2.15±0.33)的1.88倍,差异有显著性意义(P<0.01)。结论鼻咽癌病人外周血中的MDSC可能是凭借其在数量上的优势及能量代谢上的特性,更好地发挥免疫抑制效应。