一种灵长类动物的中枢神经系统功能评价方法

一种灵长类动物的中枢神经系统功能评价方法＊张晓鹏胡加飞蔡如珏黄承瑶文淑华董萍朱诚实验证实，单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因及更昔洛韦系统（ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ）对小鼠、大鼠及人脑恶性胶质瘤细胞有明显的杀伤作用［１］。该系统是目前较有希望的恶性胶质瘤基因治...

灯盏花素对大鼠脑创伤的保护作用

目的:观察灯盏花素对大鼠脑创伤后脑水肿、血脑屏障通透性和氧自由基的影响。方法:84只大鼠随机分为假手术组,模型组及低(25 mg/kg×2)、高(50 mg/kg×2)剂量灯盏花素组。采用液压颅脑损伤模型,脑创伤的同时尾静脉注射灯盏花素,8 h后重复给药一次。检测各组大鼠脑创伤后24 h脑组织含水量,伊文思蓝、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量。结果:模型组大鼠脑创伤后脑组织含水量,伊文思蓝、MDA和SOD含量与假手术组有显著性差别。大鼠脑创伤后注射低剂量和高剂量灯盏花素均可显著降低脑组织含水量、伊文思蓝含量和MDA含量,显著增加SOD含量(P＜0．05)。结论:灯盏花素可减轻大鼠脑创伤后脑水肿,其对大鼠脑创伤的保护作用与降低血脑屏障通透性、抑制氧自由基反应有关。

pLTKcSN/VPC及GCV系统的旁观者效应观察

目的：探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因（ＴＫ）逆转录病毒载体生产细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（ＧＣＶ）系统杀伤恶性胶质瘤细胞过程中的旁观者效应。方法：采用大鼠胶质瘤细胞Ｃ６、人恶性胶质瘤Ｕ８７ＭＧ和它们的转染ＴＫ阳性细胞Ｃ６ＴＫ，Ｕ８７ＴＫ，将Ｃ６与Ｃ６ＴＫ，Ｕ８７ＭＧ和Ｕ８７ＴＫ按比例（ＴＫ阳性细胞占细胞总体的０％～１００％，１０％梯度）分别混合培养于９６孔板中，每种混合比例设６孔。培养２４ｈ后，６孔中３孔加入浓度为０．５μｇ／ｍｌＧＣＶ，另外３孔作为空白对照。继续培养７２ｈ，直接计数各孔活细胞数并以对照组计数结果为本底计算ＧＣＶ对各混合比例的抑制率。结果：当ＴＫ阳性细胞占１０％时，Ｃ６和Ｕ８７ＭＧ组的抑制率达到或超过３０％，当ＴＫ阳性细胞占总体的５０％以上时，ＧＣＶ对各混合比例的抑制率接近１００％。结论：ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ和ＧＣＶ系统杀伤恶性胶质瘤细胞过程中存在明显的旁观者效应。

犬脑选择性深低温对全身重要器官生理功能的影响

目的 :探讨脑选择性降温技术的安全性。 方法 :通过单侧颈总动脉低温灌注法 ,对 10只犬进行了选择性脑部降温。观察了降温过程中生命体征的变化 ,术前及术后血常规、电解质、肝肾功能以及心脏、肝脏酶谱的变化。 结果 :10只犬均实现了选择性脑部降温。脑温最低达 (17.8± 1.8)℃ ,直肠温保持在 (32 .5± 2 .0 )℃以上。4只犬于术后 1～ 3d死亡 ,6只长期存活。降温过程中犬的生命体征有明显改变 ,随温度回升而恢复正常。术后血常规、电解质、肝肾功能、酶谱与术前无显著差异。 结论 :采用动脉内低温灌注 ,可选择性快速降低脑温。降温使脑干心血管中枢功能抑制 ,但经开放椎动脉后可迅速纠正。该技术对全身重要器官生理功能无明显损害。

过度通气对动物颅内高压时脑组织氧及二氧化碳分压的影响

目的:研究过度通气对猪急性脑内血肿颅内高压状态下脑组织氧分压(PtiO2)及二氧化碳分压(PtiCO2)、pH值和颅内压(ICP)的影响及其意义.方法:利用微泵注射自体血法建立猪急性脑内血肿模型,注入自体血并待颅内压稳定在较高水平(4.0～5.33 kPa)后,给予过度通气15 min,使PaCO2<4.0 kPa,连续监测平均动脉压(MAP)、ICP、脑灌注压(CPP)、PtiO2、PtiCO2、pH和HCO3-的变化及动脉血气变化.结果:脑内血肿组动物过度通气后,ICP、PtiCO2显著下降,CPP、pH值明显上升,而PtiO2却急剧下降至缺血水平.结论:过度通气可显著地降低ICP,但也显著地降低脑PtiO2,因此颅脑外伤后早期应避免使用过度通气.

胸苷激酶基因治疗脑胶质瘤25例报告

目的 报告25例脑胶质细胞瘤用含单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的逆转录病毒载体生产细胞（pLTKcSN/VPC）注入和羟甲基无环鸟苷（GCV）全身给药治疗脑胶质瘤2～5年随访观察（失访1例）的结果,并拟申请Ⅱ期临床试验。方法 选择大脑半球侧脑室外区确诊为脑胶质瘤的病例,在直视或显微镜下行全切除或大部分切除术,残腔周围脑组织内每隔1cm、深1.5cm用微量注射泵注入预制的基因工程细胞,10～14d后开始每天2次静脉内滴入GCV5mg·kg-1·12h-1,共14d,术后4～5周按常规给予化疗药物氯乙环已亚硝脲（CCNU）和（或）表鬼臼毒噻吩糖苷（VM26）。同时,与我院以往病情相近的经常规治疗的30例恶性胶质瘤（间变型29例,多形性胶质母细胞瘤1例）的生存率相比较。结果25例均安全渡过围手术期。在22个月以前,基因治疗组的情况均优于手术加化疗（ACCNU和VM26）的常规治疗组。基因组的中位生存时间为（470±93.17）d,12个月的生存率为0.6,18个月为0.35;常规治疗组的中位生存时间为（395±93.15）d,12个月的生存率为0.5,18个月为0.33。1例间变型少突胶质瘤患者至今已正常生活60.3个月;1例间变型星形细胞瘤患者已正常生活25个月,尚未见再发征象;另有1例多形性胶质母细胞瘤在2年时MRI才见有肿瘤扩增（47.9个月后失访）;

间隙连接蛋白connexin43基因在真核细胞中的表达

目的 :构建携带间隙连接蛋白 connexin4 3 c DNA的真核表达载体 ,建立 connexin4 3蛋白高表达细胞株。 方法 :connexin4 3 c DNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体 p ED4 ,转染中国仓鼠卵巢 ( CHO)细胞 ,用甲氨蝶呤 ( MTX)筛选得到 connexin4 3基因高表达细胞。结果 :酶切电泳结果显示载体 p ED4 -Cx4 3按设计构建。经 MTX筛选得到不同抗性的 CHO细胞 ,免疫组织化学方法显示有 connexin4 3蛋白的表达 ,但表达量有限。细胞间染料传递实验证实不同 MTX抗性的 CHO细胞间传递小相对分子质量物质的能力有差异。 结论 :利用载体 p ED4可以使 connexin4 3基因在真核细胞内表达。

海水淹溺性肺水肿对大鼠创伤性脑水肿的影响

目的探讨海水淹溺性肺水肿对创伤性脑水肿的影响。方法将72只大鼠随机均分为9组:①侧方液压打击致单纯颅脑创伤1h组;②单纯颅脑创伤6h组;③颅脑创伤合并淡水淹溺1h组;④颅脑创伤合并淡水淹溺6h组;⑤颅脑创伤合并海水淹溺1h组;⑥颅脑创伤合并海水淹溺6h组;⑦单纯颅脑创伤6h电镜组;⑧颅脑创伤合并淡水淹溺6h电镜组;⑨颅脑创伤合并海水淹溺6h电镜组。检测①～⑥组大鼠伤区脑组织含水量及Na+、K+、Ca2+含量,并行病理学检查;⑦～⑨组行伤区脑组织电镜检查。结果与单纯颅脑创伤组和淡水淹溺组相比,颅脑创伤合并海水淹溺组脑组织含水量和脑组织中Na+、Ca2+的含量显著性增加,K+含量则显著性降低,颅脑创伤后的病理及超微结构改变加重。结论海水淹溺性肺水肿可加重创伤性脑水肿与继发性脑损伤。

猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的:构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库。方法:15只成年家猫随机分为正常对照组、视神经压迫4周组和视神经压迫8周组(n=5),压迫4周组和压迫8周组猫利用球囊植入法建立慢性视神经损伤模型。取各组动物视神经,TRIzol法提取总RNA.SMART技术合成cDNA,随后利用抑制消减杂交方法分离受压4周和8周视神经中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选。随机挑取300个白色克隆进行菌落PCR鉴定。结果:菌落PCR扩增显示每个文库80%的克隆中均有200～800 bp的插入片段。结论:成功构建猫视神经慢性损伤相关差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆慢性视神经损伤相关差异表达基因奠定了基础。

RV-HSV-TKc/GCV治疗脑胶质瘤效果及其影响因素

目的研究应用逆转录病毒介导中国单纯疱疹病毒TK基因治疗系统(RV-HSV-TKc/GCV)治疗脑胶质瘤的可行性及其影响因素。方法通过体外和大鼠实验,观察转TKc细胞在治疗中的量效关系;转基因方式对疗效的影响;基因治疗细胞在瘤内的分布;治疗动物的肿瘤免疫反应。结果①TKc胶质瘤细胞对GCV的敏感浓度>0.01μg/ml,PLCTKcSN细胞与胶质瘤细胞混合培养120h较混育24h的GCV敏感性高,在GVC有效杀伤范围内,基因治疗细胞与瘤细胞数量比值>1.0;②3种方式的体内治疗结果表明TKc/GCV具有一定抑制肿瘤生长作用;③接种后第5、10、15天的针道周围可见有大量TK表达阳性细胞,距针道5mm处TK阳性细胞则难以见到,与肿瘤交界的正常脑组织无TK阳性细胞;④治疗后长期生存大鼠5只再次接种瘤细胞28d后剖检,2只未见肿瘤生长,3只有肿瘤生长但明显小于对照组;实验组NK活性和ADCC效应高于对照组。结论在治疗细胞数量足够的前提下TKc/GCV基因治疗系统对大鼠脑胶质瘤有控制生长作用;该系统具有一定调节体内主动免疫效能。治疗细胞的基因转导能力,在瘤内的分布局限性,GCV局部浓度和机体的免疫状态是影响该基因治疗效果的主要因素。

立体定向大鼠C_6脑胶质瘤动物模型的建立

目的 :通过立体定向在 SD大鼠右尾状核区接种 C6 细胞 ,建立类似于人脑胶质瘤的动物模型。方法 :SD大鼠在立体定向条件下 ,左右尾状核区接种 1× 10 6 个 C6 胶质瘤细胞 ,接种后观察实验大鼠的生成状态 ,分别于接种后 1,2 ,3周时进行 MRI检查。在实验三周时解剖标本 ,做组织病理学和 GFAP免疫组化检查。结果 :该方法建立的胶质瘤动物模型在组织病理学上接近人脑胶质瘤 ,而且具有颅内生长稳定 ,成瘤率高 ,没有颅外种植生长 ,实验周期短 ,重复性好。结论 :该大鼠脑胶质瘤动物模型能够满足胶质瘤实验治疗研究的需要 ,而且在细胞接种后 1～ 2周 ,为实验治疗较好的时机。

超深低温和复苏对犬脑的影响

目的：研究超深低温对犬脑组织缺血的保护作用。方法：建立实验犬闭胸式体外循环，体内体外结合降温，并以海脉素置换行控制性放血，至红细胞比容降至５％ 左右。中心体温７～１０℃维持低流量体外循环９０ ｍ ｉｎ。复温过程中回输自体血并予复苏。结果：７ 只犬中１ 只因技术因素死于术中，其余６ 只复苏后神经功能均恢复，但在２～４ ｈ 后均死于肺功能不全。病理检查示：脑、肝脏、肾脏正常；心脏轻度缺血性改变；肺水肿、肺泡出血明显。结论：超深低温下犬脑、肝、肾可耐受缺血９０ ｍ ｉｎ 而无明确异常，但在复苏后维持肺功能困难。

神经胶质瘤基因治疗中旁观者效应的动物试验

目的：探讨单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）Ⅰ型胸苷激酶（ＴＫ）基因逆转录病毒载体生产细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）系统杀伤大鼠脑内神经胶质瘤细胞的旁观者效应。方法：用Ｃ６，Ｃ６ＸＳＮ，Ｃ６ＴＫ及不同比例的ＴＫ（＋）和ＴＫ（－）混合细胞接种于大鼠右侧额叶脑内，５ｄ后动物腹腔内注射ＧＣＶ溶液，剂量为１５ｍｇ／ｋｇ，每日２次，共１０ｄ。细胞接种后３周，所有动物处死，测量肿瘤大小，计算各组动物的肿瘤平均体积和成瘤率；肿瘤组织作病理检查。结果：５０％Ｃ６ＴＫ和１００％Ｃ６ＴＫ两组动物的成瘤率和肿瘤平均体积明显小于其余３组；病理检查发现５０％Ｃ６ＴＫ组动物肿瘤灶内有明显的病理改变。结论：旁观者效应在动物体内也能介导ＧＣＶ的杀伤作用；

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因工程化细胞和更昔洛韦系统的急慢性毒性

目的：探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因工程化细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（ＧＣＶ）系统的动物体内急、慢性毒性。方法：将ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ和（或）以β－半乳糖苷酶基因为报告基因的ＰＡ３１７细胞悬液注入小鼠、大鼠和灵长类动物体内，７ｄ后部分动物再全身应用ＧＣＶ。分批处死动物，观察ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ和ＧＣＶ系统在不同种属动物的体内急、慢性毒性。采用ＰＣＲ和原位杂交方法直接检测胸苷激酶基因在动物脑和全身各脏器内的整合及表达情况。结合原位杂交和Ｘ－ｇａｌ染色结果，判断注射细胞在动物脑内的存活时间。结果：ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ和ＧＣＶ系统对动物的心、肝、肺和肾有一定的急性损害作用。该细胞在大鼠和猴脑内的存活时间为３周。

视神经慢性损伤相关差异表达cDNA文库的鉴定与分析

目的：对构建的猫视神经慢性损伤相关差异表达cDNA文库进行初步克隆、鉴定和分析。方法：用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行cDNA文库扩增和蓝白斑筛选，每个文库随机挑取300个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。对阳性克隆菌落进行DNA测序以获得差异表达基因片段序列。将测序所得的序列通过互联网用Blast程序查找日本国家DNA数据库进行同源性分析。用实时定量PCR验证差异克隆。结果：PCR鉴定获得1000个阳性菌落，测序获得674个EST片段，序列长度在200～800bp之间。同源性分析结果提示4周正向文库得到14个同源基因，4周反向文库得到20个同源基因，8周正向文库得到23个同源基因，8周反向文库得到19个同源基因。这些基因可归类于能量代谢、物质转运、信号转导、基因转录、细胞损伤与修复、MHC分子等。实时定量PCR检测的4个克隆证实是差异表达序列。结论：本研究构建的视神经慢性损伤相关差异表达cDNA文库为进一步鉴定和研究慢性视神经损伤相关基因提供了实验基础。

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因及更昔洛韦系统对S-D大鼠的毒副作用

旨探讨将单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因载体生产细胞（pLTKcSN／VPC）脑内注射和腹腔注射更昔洛韦（GCV）在大鼠体内的急性系统性毒副作用，以及载体生产细胞（VPC）在大鼠脑内的存在时问。S-D大鼠24只，雌雄各半，随机分为2组。第1组颅内注射pLTKcSN／VPC，细胞总量3ｘ106/只，7天后腹腔注射GCV30mg·kg-1·d-1，共7天。GCV用药结束后1周处死动物，进行备脏器组织学检查及TK序列的聚合酶链反应（PCR）和原位杂交检测。第2组，采用脑内注射等量整合有β半乳糖苷酶基因（β-gal／nVPC），注射后的9、14、21和30天各处死3只动物，取注射针道周围脑组织行冰冻切片x-gal组化染色，观察VPC在大鼠脑内的生存时限。结果：第1组动物的各脏器组织学病理改变主要为脑内手术部位蛛网膜下腔出血、个别动物有心肌间质灶性炎症和肝细胞脂肪变性。TK序列聚合酶链反应（PCR）检测动物体内各脏器均未检出TK序列。x-gal组化染色见9天和21天两个时问点分别有1只动物脑内有阳性细胞存在。本文结果提示：pLTKcSN／VPC及GCV系统对大鼠脑及全身各脏器有轻微非特异性急性毒副作用，pLTKcSN／VPC在大鼠体内的生存时间约为3周。为pLTKCSN／VPC及GCV系统的临床试验治疗恶性脑胶质瘤提供了脑内注射PLTK。SN／VPC的安全性依据。

重组胶质细胞生长因子2蛋白的原核表达及纯化

目的通过原核表达的方法得到胶质细胞生长因子2(GGF2)重组蛋白。方法将不含信号肽编码序列的GGF2基因用亚克隆的方法自PVT-GGF2质粒克隆至PCXJ18质粒,再由PCXJ18-GGF2质粒克隆至pET-32b(+)质粒,构建pET-32b(+)-GGF2表达载体。表达载体转染4种宿主菌,筛选合适者。优化表达时程和IPTG诱导剂量。GGF2大量表达后回收包涵体,复性。复性产物利用His Bind树脂进一步纯化。纯化产物用Western blot鉴定。结果测序鉴定表明,成功构建pET-32b(+)-GGF2表达载体。筛选结果表明Origami B(DE3)为合适宿主菌。适宜的表达条件为30℃诱导前扩增,浓度25μmol/L IPTG,37℃诱导2 h。所表达外源蛋白相对分子质量和预期一致。回收、纯化后得到纯度约为96%的产物。Western blot鉴定表明所获为GGF2重组蛋白。结论原核表达方法得到足量GGF2重组蛋白。

疮疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因和更昔洛韦系统治疗脑恶性胶质瘤的临床观察及护理

目的探讨和观察单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因（TK）逆转录病毒载体生产细胞（PLTKcSN／VPC）结合羟甲基无环鸟苷（GCV）系统治疗（基因治疗）恶性胶质瘤的方法在人体内的安全性。方法在围手术期内对接受该治疗的患者进行临床观察和护理。结果19例患者接受该治疗后产生一些轻微的毒副作用，包括发热、神经系统症状、心血管及消化系统反应，对症处理后均可控制。结论通过密切观察和护理，可有效地预防和减轻治疗后不良反应。

间隙连接蛋白43在 HSV-tk-GCV系统旁观者效应中的作用

目的 :研究细胞间间隙连接蛋白 (connexin43,Cx43)与基因治疗中旁观者效应的关系。方法 :将不同 Cx43表达水平的中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)转染 tk基因 ,tk+ / tk- 细胞按不同比例混合 ,经更昔洛韦 (GCV )作用后 ,用细胞计数和流式细胞仪检测混合细胞体系生长抑制率。将上述混合细胞接种于裸鼠皮下 ,腹腔给 GCV 15 mg/ kg,每日 2次 ,3周后处死 ,观察皮下 CHO细胞结节的大小。结果 :体外实验证实 tk+ / tk- 混合细胞经 GCV作用后生长受抑制的程度与 Cx43表达水平有关 ,Cx43表达水平高的混合细胞在含有 5 % tk+ 细胞时就表现出旁观者效应 ,而 Cx43表达水平低的混合细胞在含有 2 0 % tk+ 细胞时才表现出明显的旁观者效应。实验发现 Cx43表达水平高的混合细胞动物皮下种植后经过 GCV作用 ,细胞结节的体积明显小于 Cx43表达水平低的混合细胞结节体积。结论 :在 HSV- tk-