寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)细胞核骨架与中间纤维的研究

甲藻(涡鞭毛虫,dinoflagellate)的细胞核是现存真核生物中最原始的。我们采用整装细胞制样和非树脂包埋去包埋剂超薄切片电镜技术,结合选择性生化抽提方法显示在寇氏隐甲藻(Cryptheccdinium cohnii)细胞中存在一个以水不溶性纤维蛋白成份为主的,贯穿于细胞核和细胞质的纤维网架系统,即核骨架-中间纤维结构体系,而Lamina结构不明显。免疫印迹法显示,甲藻细胞中存在类角蛋白组分,分子量为63kD和67kD,哺乳动物Lamin抗体与甲藻细胞全蛋白反应阴性。实验结果表明,在原始真核细胞中已经出现了类似于哺乳动物细胞的核骨架和中间纤维,并提示核骨架-中间纤维细胞骨架体系可能起源于真核细胞起源早期。本文对Lamina与中间纤维在进化上的关系及Lamina在真核细胞进化中的功能意义作了讨论。

四膜虫细胞的核骨架及类中间纤维

采用非树脂包埋去包埋剂超薄切片结合选择性生化抽提方法显示，原生动物四膜虫细胞大核具有发达的核骨架纤维网络，核周是一层完整的核纤层结构，在四膜虫细胞小核中，亦存在核骨架和核纤层。四膜虫细胞皮层中存在水不溶性纤维网架，其中含有类中间纤维蛋白组分，４９ＫＤ蛋白。

应用DGD包埋去包埋剂电镜方法研究染色体骨架

我们将染色体骨架制备方法与非树脂包埋去包埋剂超薄切片电镜方法结合起来，直观地显示染色体骨架的内部结构，分离的染色体骨架保持了与正常染色体对应的形状和大小，染色体骨架是一贯穿于整个染色体中的纤维网架结构，而不是位于染色体核心的轴，实验结果表明，ＤＧＤ包埋去包埋剂超薄切片电镜方法是研究染色体骨架超微结构的有力手段。

波形纤维蛋白与Nup 180的体外结合

本文作者采用大肠杆菌表达的波形纤维蛋白与大鼠肝细胞分离的核孔蛋白进行体外结合实验,以分析波形纤维与核孔的关系。实验结果显示,细菌表达的波形纤维蛋白在体外能组装成10 nm纤维,在体外反应体系中加入核孔蛋白后,室温反应30 min,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹法检测,结果表明180 kD核孔蛋白(Nup 180)与波形纤维蛋白有亲和反应。结合免疫胶体金标记与电镜负染色方法显示,核孔蛋白结合于体外装配的10 nm波形纤维上。本文结果提示在细胞内波形纤维可能通过与Nup 180的结合锚定于核孔复合体上。

Nuclear Lamina(核纤层)——一种重要的细胞核结构

Nuclear lamina(核纤层)是细胞核内膜下由1至3种纤维蛋白(lamin)所构成的纤维网络或片层结构。Lamina与中间纤维及核内骨架相互联结,形成贯穿于细胞核和细胞质的骨架体系。Lamin与中间纤维蛋白具有同源性;Lamin的表达与细胞分化有关;Lamina在细胞分裂期中发生解聚和重装配。Lamina对核膜和染色质起支架作用,并与细胞核构建有关。

细胞核体外重建过程中核纤层与核膜组装的关系

核纤层Nuclear lamina是位于内层核膜下的纤维蛋白片层结构,为了研究核纤层与核膜在功能上的关系,我们利用体外核装配这一实验模式,初步探索了核纤层与核膜装配的关系。首先,我们应用噬菌体Lambda DNA和非洲爪蟾卵细胞抽提物建立了体外细胞核组装体系,体外构建的细胞核具有正常细胞核的形态结构(图1),同时证明核纤层参与了细胞核的体外组装。为进一步探讨核纤层在细胞核组装过程中的作用,我们在非细胞体系中加入足量的能与两栖类卵细胞核纤层蛋白Lamin Ⅲ反应的抬体,观察核纤层蛋白抬体对核膜组装的影响,超薄切片电镜观察显示核纤层蛋白抬体的介入导致非细胞体系中膜系组装的紊乱,不能形成正常的双层核膜,而是形成呈同心圆状排列的多层单位膜(图2)。其机制有待进一步探讨,推测核纤层蛋白单体组装成核纤层可能是细胞核组装过程中的一个重要环节,这一环节的缺失导致了膜系统,特别是双层核膜的组装异常。

上皮细胞分裂过程中中等纤维的变化

应用制备的血清抗体,采用免疫细胞化学方法观察了两株培养上皮细胞的分裂过程中IF的动态变化过程。实验结果显示,在上皮细胞分裂过程中,IF形态结构及空间分布发生了显著变化,不同细胞之间存在差异,分裂的Vero细胞中角蛋白纤维和波形纤维都维持纤维形态,围绕分裂器形成纤维网罩或纤维束环,随着细胞分裂的进行,IF网的空间组织结构和外观发生动态变化;分裂的HeLa细胞中,角蛋白纤维和波形纤维广泛重组形成颗粒状胞质小体,分裂结束后重建IF网。实验结果表明,IF变化具有细胞周期依赖性和一定的细胞特异性。本文对IF在细胞分裂过程中的功能意义作了讨论。

免疫胶体金标记显示波形纤维与核孔复合体的结合

中间纤维与细胞核的关系是一个亟待解决的重要问题。本文采用火鸡红细胞作为研究材料,首先用细胞分级抽提结合免疫印迹反应显示火鸡红细胞中间纤维蛋白为波形纤维蛋白。然后,我们采用细胞分级抽提结合包埋前免疫胶体金标记的方法显示胞质中间纤维被抗波形纤维蛋白抗体-蛋白A-胶体金特异标记。同时,我们显示结合于核孔复合体上的胞质纤维被抗波形纤维蛋白抗体-蛋白A-胶体金所特异标记。本文结果表明,结合于核孔复合体上的胞质纤维是波形纤维,并且提示波形纤维可能通过与Nup 180的结合附着在核孔复合体上,为进一步探讨中间纤维与核孔运输的关系提供了初步实验证据。

应用免疫胶体金技术对核骨架-Lamina-中间纤维体系标记定性

用选择性系列抽提技术与整装制样方法相结合,清晰地显示了Hela细胞与BHK_(-21)细胞的核骨架—Lamina—中间纤维结构体系。在此基础上,用电镜免疫胶体金标记技术对这一精细结构体系的成份分别进行定性研究,实验结果说明:Hela细胞与BHK_(-21)细胞核骨架纤维均能被298KD的核骨架蛋白单抗—金颗粒标记,它们的Lamina均被LaminA单抗—金颗粒标记,Hela细胞的中间纤维既能被角蛋白单抗又能被波形蛋白单抗—金颗粒所标记,而BHk_(-21)细胞的中间纤维却只能被波形蛋白单抗—金颗粒标记,不能被角蛋白单抗—金颗粒标记,但BHK_(-21)细胞的Lamina却与角蛋白单抗有交叉反应。将核骨架—Lamina—中间纤维体系的精细结构与其蛋白成份的定性同时准确地显示出来,至今尚未见过报导。

Lambda DNA诱导非细胞体系核重构过程的超微结构研究

非洲爪蟾未受精的卵细胞去胶膜后,经钙离子载体A23187活化及松胞素B处理,10,000G离心裂胞,除掉脂滴、卵黄颗粒、色素颗粒及卵核等,可得到可溶性胞质。在可溶性胞质中先加入ATP再生系统。将在65℃处理5分钟的Lambda DNA引入上述爪蟾卵非细胞体系,置22℃温育。以温育开始为零时,每隔一定时间取样固定做电镜观察,共取到温育4小时。取出的样品用戊二醛、锇酸双固定,Epon812包埋后做超薄切片,经醋酸双氧铀——柠檬酸铅染色,在JEM-100CX透射电镜下观察。同时按常规方法做冰冻蚀刻观察。

四膜虫(Tetrahymena thermophila)核纤层的研究

采用非树脂包进埋去包埋超薄切片电镜技术,并结合选择性生化抽提方法以及间接免疫荧光染色方法显示,在四膜虫(Tetrahymena thermophila)细胞内存在典型的核纤层结构。蛋白分离纯化与免疫印迹法分析结果说明四膜虫细胞核纤层可能主要由分子量为66KD的多肽构成。蛋白分离纯化结果表明四膜虫细胞的核纤层蛋白可能不如高等动物细胞的丰富。

采用免疫胶体金标记结合负染色电镜技术对体外组装的中间纤维定性

将免疫胶体金标记与电镜负染色技术相结合，清晰显示体外组装的波形纤维具有１０ｎｍ中间纤维结构特征，抗波形纤维蛋白－金颗粒特异地标记在波形纤维上。用抗波形纤维蛋白－金颗粒对体外组装的微管进行标记则呈阴性反应。实验结果表明将免疫胶体金标记与电镜负染色技术相结合可以同时显示体外组装的细胞骨架纤维的精细结构和蛋白属性。

四膜虫(Tetrahymena thermophila)核纤层的研究

核纤层(nuclear lamina)是高等动物细胞中普遍存在的核结构。核纤层位于间期细胞核内层核膜下,是由1—3种核纤层蛋白构成的球状网络,其切面观呈片层结构。在细胞分裂间期核纤层为核被膜提供支架,并可能是间期染色质在核周锚锭位点。在有丝分裂过程中,核纤层参与核被膜的崩解与重新形成过程。迄今为止,对核纤层的研究主要集中于高等动物细胞。单细胞真核生物的核纤层报道甚少。核纤层是否普遍存在于所有真核细胞仍是一个有待回答的问题。

鸡和小鼠具核红细胞的中间纤维-核纤层-核骨架体系

应用选择性系列抽提结合整装细胞电镜技术,在电镜下对鸡胚原始红细胞、鸡成熟红细胞和小鼠胚肝幼红细胞内的中间纤维-核纤层-核骨架体系的形态结构进行了观察。鸡胚和成鸡红细胞的中间纤维由束状或结节状的物质连接交织成为致密的网络,直接与较厚的核纤层和质膜相连接。核骨架为由粗细不一的纤维形成立体网络,纤维与核纤层密切相连。小鼠胚肝幼红细胞的中间纤维较鸡红细胞的纤细和稀疏,核纤层较稀薄,核骨架网络较致密而在纤维上粘附有大小不等的颗粒状物质。SDS-PAGE电泳和抗波形纤维蛋白抗体所做的Western blotting探测结果表明,具核红细胞中的中间纤维成分以波形纤维蛋白(vimentin)为主。

从实际出发,把人事工作做好

“人事”作为一种社会现象,客观存在着各种各样的矛盾。当前,人事工作给人事干部提出了许许多多客观实在的新课题,要求人事干部不断地研究人事工作在改革开放中的内在联系,探索人事工作在社会主义初级阶段的客观规律性,不断地提出问题、分析问题、解决问题,保证人事制度沿着正确轨道不断完善。联系本人多年人事工作的实践,深刻体会到,只有坚持实事求是的思想路线,一切从实际出发,具体问题具体分析,才能减少失误,提高效率。一、坚持实事求是做人事工作,首先碰到的一个问题,就是如何看待“人事”这种现象。有的人认为,“人事”仅仅是某些领导人主观意志的产物,要么觉得摸不得,使人事工作披上一层神秘的面纱;

防止桃树内膛光秃的修剪技术

桃树内膛容易过早光秃,导致结果部位外移,盛果期缩短.如何延长桃树经济寿命,保持立体结果,达到优质丰产,是当前桃树生产中亟待解决的问题,也是果农最关心的问题.

一种原始真核细胞——寇氏隐甲藻的染色体骨架

在真核生物进化研究中,对核膜与染色体的起源与进化已有较多阐述,而染色体骨架领域尚是空白,甲藻是一类原始真核生物,可能代表了原核生物与真核生物之间的过渡类型,在真核生物的染色体中,甲藻的染色体最近似于原核生物的类核体。在这样一种原始的染色体中,是否存在与高等真核生物类似的染色体骨架,至今尚无报道,值得注意的是,尽管甲藻染色体中碱性蛋白(组蛋白)的含量很少,但酸性蛋白(非组蛋白)的含量与高等真核细胞相似。在缺乏组蛋白及核小体的情况下,非组蛋白在染色体中的作用更值得注意。我们将染色体骨架制备方法与非树脂包埋去包埋剂超薄切片电镜方法结合起来。

利用非洲爪蟾卵的提取物与Lambda DNA进行核重构试验

近年,在国际重要学术刊物上先后发表多篇有关“核重构(或核组装)”的论文,一些科学家认为这是近年细胞生物学领域重要进展之一。我们认为虽然对其理论意义及其在生物工程实践中应用前途的评估还为时过早,但这项研究的前景是令人鼓舞的。体外核重构实验模式的建立对阐明细胞核、染色质、核膜与核骨架的组装及其功能的相互关系以及一系列重要生命现象,无疑将提供一个良好的实验模式。

HeLa细胞有丝分裂过程中280kD核骨架蛋白的变化

核骨架(nuclear matrix)是细胞核中以纤维蛋白成分为主的网架体系,近年来的研究表明,核骨架与细胞内许多重要的生命活动有关,如DNA复制、RNA转录和加工、细胞核及染色质的构建等.

体外组装的细胞核中的核骨架

细胞核组装(nuclear assembly)普遍存在于真核细胞生命过程中,如有丝分裂和减数分裂完成后细胞核的重组装,是研究细胞核构建与功能的良好模型.但生物体乃至单个细胞是相当复杂的系统,各种因素错综复杂,相互作用,不易操作、控制和分析,细胞核体外组装系统(cell free nuclear assembly system)的建立提供了一个很好的实验模式.核骨架(nuclear matrix)是细胞核内以纤维蛋白成分为主的纤维网架结构。