4b型单核细胞增生李斯特菌内化素基因NTSN_0462的功能初探

目的单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对宿主的粘附、侵袭作用与其多种内化素蛋白密切相关。本研究以4b型菌株LmNTSN的內化素基因NTSN_0462为研究对象,初步探究其致病作用。方法利用同源重组技术构建该基因缺失的突变株,研究0462基因对NTSN在生长、细胞侵袭和体内定植中的作用。人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2的侵袭率,以及BALB/c小鼠体内肝、脾脏中定植能力的差异。结果缺失株的生长曲线结果显示,NTSN_0462基因对Lm在BHI培养基中的生长及代谢未造成明显影响。以人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2进行的体外试验表明,缺失株的侵袭能力低于野生株(P<0.001)。以BALB/c小鼠进行的体内试验显示,缺失株在肝脏中定殖的能力显著低于野生株(P<0.001),在脾脏中无统计学差异。结论 NTSN_0462基因在LmNTSN入侵肝脏和定植中发挥重要作用,是侵袭相关的重要毒力因子。

单核细胞增生李斯特菌NTSNΔ0287缺失株的构建及其生物学特性

内化素蛋白家族是一类重要的表面蛋白,其与单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对宿主的黏附侵袭作用密切相关。Lm NTSN_0287基因编码含有信号肽序列和LRR重复结构域的内化素家族蛋白,其作用机制有待于阐明。通过荧光定量PCR的方法,发现该基因在Lm侵袭Caco-2细胞时上调表达,达到体外表达量的1 300倍。为明确该基因的生物学特性,研究利用同源重组技术构建了LmNTSNΔ0287缺失株。与野生株相比,NTSNΔ0287缺失株对Caco-2细胞的黏附与侵袭能力均显著降低,对HeLa细胞的黏附能力下降,侵袭能力增加。经口服和尾静脉途径接种BALB/c小鼠,NTSNΔ0287缺失株在脾脏和肝脏中的载菌量均降低,但其LD_(50)与野生株相比无明显差异。因BALB/c小鼠缺乏人所特有的细胞表面内化素受体E-cad,并不是最佳实验动物模型,下一步将选用同时具有内化素受体E-cad和Met的沙鼠做进一步研究。

单核细胞增生李斯特菌hfq基因缺失株的构建及其生物学特性

【目的】单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)为革兰氏阳性的短杆菌,营腐生和寄生生活,是重要的食源性人兽共患病原菌,对低温、酸碱和高渗透压等环境具有较强的抵抗力。Lm在各种环境中适应、生存并表现致病力,是与调控因子的网络调控密切相关,本文初步研究了细菌调控因子hfq的生物学特性。【方法】利用同源重组技术对血清型为1/2 a的EGDe菌株进行hfq基因的敲除,对获得的突变株EGDe△hfq进行生化鉴定及生物学特性研究。【结果】实验结果表明:在4℃低温环境下,缺失株生长显著减慢(P<0.05);在含7%Na Cl高渗BHI培养基及含4.5%乙醇的BHI培养基中生长受到抑制;缺失株形成生物被膜的能力显著下降(P<0.05);对Caco-2细胞系的侵袭能力下降;与野生型菌株相比,EGDe△hfq对BALB/c小鼠的感染能力减弱、半数致死剂量提高。【结论】由此表明,Hfq蛋白对细菌抗胁迫、生物被膜形成及细菌毒力具有重要的调控作用。此缺失株的构建为进一步研究Hfq的功能提供了材料,为研究其在Lm胁迫环境生存及疾病预防控制奠定了基础。