异体骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病足溃疡及血管内皮生长因子的表达

背景:目前在临床多采用自体骨髓干细胞及自体外周血干细胞治疗糖尿病足溃疡,少见利用骨髓间充质干细胞治疗糖尿病足溃疡的基础研究。目的:观察局部移植异体骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病足溃疡的效果及血管内皮生长因子的全身及局部表达情况。方法:取雄性Wistar大鼠90只,随机数字表法分为3组:对照组(正常足部溃疡)、干细胞治疗组、糖尿病对照组。干细胞治疗组、糖尿病对照组建立2型糖尿病足溃疡模型,造模后分别注射同种异体骨髓间充质干细胞、干细胞培养基DMEM。造模后第1,4,8天观察各组大鼠溃疡面积、细胞核染色示踪及病理学检查,ELISA法测外周血血管内皮生长因子浓度、Western-blotting法测局部血管内皮生长因子浓度。结果与结论:与糖尿病对照组比较,干细胞治疗组溃疡愈合速度迅速,但仍较对照组愈合缓慢,外周血中血管内皮生长因子表达增高,也未达到正常水平。异体干骨髓间充质干细胞治疗前期(1～4d)能明显提高局部血管内皮生长因子浓度,但在后期(8d)局部浓度提高不足。干细胞治疗组愈合缓慢,表皮覆盖不完全,但较糖尿病对照组愈合明显提前,表皮覆盖较明显;细胞核染色示移植后干细胞均聚集于溃疡区周围。提示异体移植骨髓间充质干细胞可促进大鼠糖尿病足溃疡的愈合,其促进愈合的可能机制为其上调了血管内皮生长因子在全身尤其局部的表达。

过氧化氢导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能关系的研究

目的 探讨过氧化氢 (H2 O2 )导致线粒体DNA(mtDNA)编码细胞色素C氧化酶 (COX)基因损伤(突变 )后对其编码蛋白结构与功能的影响及两者之间的关系。方法 采用生物信息学技术 ,运用计算机同源模建的方法模拟人天然COX亚单位和其突变体的空间结构 ,并利用已有的实验数据 ,结合模建的结果进行了结构、功能的分析、研究。结果 在COXⅠ的三维结构中突变的部位 (残基 2 97～ 30 6 )位于分子的最外部 ,而该区域参与了与B亚基 (相当于COXⅡ亚基 )的作用 ,该部位的突变使突变部位附近残基的侧链结构环境发生了极大的变化 ,导致附近的电荷性质、亲疏水性质和空间特性出现变化 ,这些变化对酶复合物的形成有直接的影响 ;COXⅡ突变后 ,组成分子结构的“椅靠”部分和“椅面”部分之间的夹角略有增大 ,而“椅靠”和“椅面”之间的夹角的变化将会影响整个酶分子的稳定性。结论 H2 O2 导致的mtDNA编码COXⅠ、COXⅡ亚基基因突变使其编码的COX蛋白空间结构发生改变 ,这种改变是其功能改变 (如酶蛋白活性下降 )的主要原因。

转染血管内皮生长因子基因的骨髓间充质干细胞修复糖尿病大鼠足背创面

背景:糖尿病足溃疡严重威胁患者的健康甚至生命,其治疗仍是国际性难题,目前缺乏良好有效的治疗手段,而基因疗法和干细胞疗法在创伤修复领域展现出独特的优势和潜力。目的:探索转染人血管内皮生长因子165(human vascular endothelial growth factor 165,hVEGF165)基因的骨髓间充质干细胞对大鼠糖尿病足背创面的治疗效果。方法:体外构建hVEGF165基因的腺病毒表达载体,转染第3代大鼠骨髓间充质干细胞;将120只雄性Wistar大鼠分成正常溃疡对照组、模型组、基因治疗组、干细胞治疗组和基因转染干细胞治疗组。后4组大鼠经腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病,在所有大鼠的后足背切取一3 mm×7 mm矩形全层皮肤制成足背创面模型。各组大鼠均在足背创缘皮下分点注射移植,距创缘5 mm处、等距6点,正常溃疡对照组和模型组各点均注射50μL的PBS,基因治疗组各点注射50μL的腺病毒悬液(1×1013 pfu/L),干细胞治疗组各点注射50μL的干细胞悬液(1×1010 L-1),基因转染干细胞治疗组各点注射50μL的病毒转染后的干细胞悬液(1×1010 L-1)。结果与结论:与模型组、基因治疗组、干细胞治疗组相比,基因转染干细胞治疗组大鼠创面愈合率、血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达水平、局部毛细血管数量均有显著提高(P<0.05),但较正常溃疡对照组差(P<0.05)。说明hVEGF165基因联合骨髓间充质干细胞疗法能够促进大鼠糖尿病足背创面的愈合,其主要机制为促进局部血管的生成及血管内皮生长因子的表达。

过氧化氢对肠上皮细胞线粒体膜电位及细胞凋亡的影响

目的 :探讨过氧化氢在体外对肠上皮细胞线粒体膜电位的影响及其与细胞凋亡的关系。方法 :肠上皮细胞株 (SW -4 80 ) ,采用过氧化氢 (H2 O2 )损伤模型 ,用 5 0、10 0、2 0 0、4 0 0 μmol·L-1和 4mmol·L-1作用 1、3、6、12及 2 4h。线粒体功能采用噻唑蓝法 (MTT法 ) ;用罗丹明 (Rhodamine- 12 3)荧光探针检查活细胞线粒体膜电位变化 ;用Annexin -Ⅴ荧光探针 ,流式细胞仪检测早期凋亡细胞 ;同时观察细胞形态学和线粒体超微结构的改变。结果 :H2 O2 在低浓度 (5 0、10 0、2 0 0 μmol·L-1)时线粒体功能未见明显改变 ,在高浓度 (4 0 0 μmol·L-1、4mmol·L-1)时可导致线粒体功能不可逆的进行性下降 ,线粒体内嵴减少、肿胀 ;同时使线粒体膜电位显著降低 ,细胞凋亡率显著增加。结论 :线粒体参与了H2 O2 诱导肠上皮细胞的早期程序性死亡及随后的细胞死亡 ,这种损伤作用与线粒体结构、功能改变和膜电位下降密切相关。

早期短程应用亚胺培南在防治大鼠烧伤后肠源性感染中的作用

目的 探讨早期短程应用亚胺培南对严重烫伤大鼠肠道细菌移位的影响及其对脏器功能的保护作用。方法 治疗组采用大鼠 3 5 %～ 40 %Ⅲ度烫伤模型 ,伤后立即静脉注射亚胺培南 ( 4 0mg·kg- 1 ·d- 1 ) ,连续 2d ;同时设正常及烫伤对照组。于 72h活杀动物。留取组织及血标本 ,分别对血液、内脏及肠系膜淋巴结进行细菌定量培养 ,同时检测器官功能指标。结果 治疗组动物肠系膜淋巴结、内脏及血液中细菌移位率明显低于烫伤组 (P <0 .0 5 ) ,且与烫伤组比较血清丙氨酸转氨酶 (ALT)、天门冬氨酸转氨酶 (AST)、尿素氮 (BUN)水平明显下降 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1)。结论 严重烧伤早期短程应用广谱高效的抗生素 (亚胺培南 )能明显降低细菌移位率 ,预防肠源性感染的发生 。

过氧化氢导致肠上皮细胞线粒体DNA编码基因损伤的研究

目的 :探讨过氧化氢 (H2 O2 )对肠上皮细胞线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶、ATP合成酶基因的损伤作用。方法 :肠上皮细胞株 (SW - 4 80 ) ,采用 4mmol·L-1H2 O2 处理细胞后进行线粒体DNA的提取 ,对细胞色素C氧化酶 (COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ )基因、ATP合成酶 (ATPase 6亚基、ATPase8亚基 )基因进行PCR扩增 ,并将PCR产物进行直接测序。结果 :细胞色素C氧化酶COXⅠ从 6 80 3～ 6 84 8出现大范围的点突变及 70 2 7出现点突变 (TC) ,在 732 9(CG)、7341(TG)、735 2 (GA)出现点突变 ,在 7337出现缺失突变 (缺T) ;COXⅡ序列在 82 19～ 82 6 0段出现大范围的点突变 ;Atpase 8亚基基因在 8385～ 85 4 3段出现大范围的点突变。结论 :H2 O2 可明显损伤mtDNA编码的细胞色素C氧化酶及ATP合成酶基因。

高原严重烧伤延迟复苏大鼠脑损伤与兴奋性氨基酸水平变化

目的:观察高原严重烧伤延迟复苏后早期大鼠脑损伤及兴奋性氨基酸含量的变化.方法:130只雄性Wistar大鼠随机分为烧伤即时复苏组(n=60)、烧伤延迟复苏组(n=50)和正常对照组(高原地区正常对照组n=10和兰州地区正常对照组n=10).前两组动物被制成高原(海拔3800m)烧伤实验动物模型(TBSA30%,Ⅲ度).运用高效毛细管电泳法检测脑组织中兴奋性氨基酸(谷氨酸,Glu)含量,采用干、湿重比重法测定脑组织含水量,原位末端标记(TUNEL)观察脑皮质神经细胞凋亡.结果:从兰州地区急进高原后,大鼠脑组织Glu含量、脑组织含水量、脑皮质中TUNEL阳性细胞数均未发生明显改变(P>0.05);高原严重烧伤后脑组织Glu水平于伤后1h即显著降低,持续至伤后24h,于伤后72h恢复至正常水平(P<0.05);延迟复苏组脑组织Glu水平在观察时限内均低于上述两正常对照组,延迟复苏组与即时复苏组相比除在伤后12h时相点无统计学差异外,其余时相点均低于即时复苏组(P<0.05).而脑组织含水量于伤后6h开始升高,于24h达高峰,于伤后7d降至正常水平;高原烧伤延复组变化趋势同高原烧伤即复组,但伤后7d仍未恢复.脑皮质TUNEL阳性细胞在伤后1h即增多,也于伤后24h达高峰,伤后7d仍高于正常水平.结论:由兰州地区急进到高原地区,并不足以导致大鼠脑组织中兴奋性氨基酸含量发生变化及大鼠脑水肿的发生和脑皮质凋亡细胞数的增加;高原严重烧伤及延迟复苏后,细胞外兴奋性氨基酸减少,同时伴有受伤大鼠迅速出现脑水肿,脑皮质凋亡细胞显著增加.

枯否细胞在大鼠烫伤早期肝损伤中的作用

目的 探讨枯否细胞在烧伤后对肝细胞的作用。方法 以 30 % 度烫伤大鼠为模型 ,采用枯否细胞与肝细胞联合培养体系 ,检测培养上清中 MDA、TNF、AL T、L DH的变化及添加 TNF单抗的影响。结果 烧伤后活化的枯否细胞与正常肝细胞及烧伤后受损肝细胞联合培养组上清中 AL T、L DH、MDA、TNF含量显著增高 ;在培养上清中加入 TNF- α单抗后培养上清中 TNF含量较对应组显著下降 ,但 AL T、L DH却无明显改变。结论 烧伤后肠源性内毒素等可激活枯否细胞 ,而活化后的枯否细胞在体外亦能持续合成并分泌毒性介质 (如氧自由基、TNF等 ) ,从而介导肝细胞的损害 ,且这种损伤作用对受损的肝细胞更明显 ;TNF对肝脏无直接损害效应 ,必须依赖于其他因素 ,如

面部角化棘皮瘤的手术治疗

目的:探讨面部角化棘皮瘤的手术治疗,并对由此而产生的局部美学问题进行初步讨论。方法:2001年3月～2003年7月,收治面部角化棘皮瘤患者6例,分别采用病灶切除直接缝合及全厚皮片移植的方法修复创面。结果:6例患者切口愈合良好及移植皮片完全成活,术后外形恢复满意。结论:由于其迅速增长的性质及与鳞癌的不确定关系,我们认为面部角化棘皮瘤应尽早行完整手术切除,以取得良好的结果及减轻复发率。

高原烧伤大鼠脑损伤与细胞凋亡的动态变化

目的探讨高原严重烧伤延迟复苏后早期大鼠脑组织病理变化及细胞凋亡的变化规律。方法130只雄性Wistar大鼠设计高原（海拔3800m）烧伤实验动物模型（TBSA30％，Ⅲ^0），并随机分4组：A组（高原烧伤即时复苏组）、B组（高原烧伤延迟复苏组）和C组（高原正常对照组），同时设D组（兰州地区正常对照组）（海拔1517m）。采用干、湿重比重法测定脑组织含水量，运用末端脱氧核苷酸介导的X—d UTP缺口末端标记法（TUNEL）测定脑皮质细胞凋亡阳性细胞数，光镜下观察病理变化。结果A组大鼠脑组织含水量于伤后6h开始升高，于24h达高峰（71．70±2．32），于伤后7d降至正常水平；B组变化趋势同A组。脑皮质TUNEL阳性细胞在伤后1h即增多，于伤后24h达高峰（233．33±16．22），于伤后7d仍高于正常水平。病理改变：C组脑实质内神经细胞、毛细血管形态基本正常。A组伤后早期（1h、6h）即见神经元嗜酸性染色增强，伤后24h病理变化明显，伤后7d基本恢复至正常；B组变化趋势同A组，伤后7d，神经细胞及血管形态、分布、周围间隙仍未完全恢复正常，部分神经元坏死、溶解。结论高原严重烧伤后，受伤大鼠迅速出现脑水肿，同时伴有脑皮质凋亡细胞显著增加，且延迟复苏组脑组织病理改变明显加重。

肠源性内毒素在烧伤后诱导肝损伤中的作用

目的;探讨烧伤后肠源性内毒素在肝损伤中的作用.方法:大鼠30%Ⅲ度烧伤模型,免疫组化染色检测TNF蛋白在肝组织中的表达及细胞定位,并观察门静脉血浆内毒素、肝组织IL-8、MDA及腔静脉血清ALT、LDH含量变化的关系.结果:正常大鼠肝组织中有少量枯否细胞表达TNF蛋白,烧伤后TNF蛋白表达阳性细胞数迅速增加,其动态变化与门静脉血浆内毒素的变化极为相似.烧伤后腔静脉血清中ALT、LDH及肝组织中IL-8、MDA水平亦显著升高,结论:肠源性内毒素是导致烧伤早期肝损伤的主要因素之一;这种损伤效应乃由其刺激单核吞噬细胞系统产生的多种细胞因子介导的;中性粒细胞可能也参与了肝损伤过程.

褥疮的临床分型及手术治疗原则

目的探讨临床褥疮的分型及根据其分型进行手术治疗原则及方法。方法1983年1月~2006年4月,收治褥疮患者122例179处。男93例,女29例;年龄15~68岁。褥疮位于骶尾部54处,股骨大转子37处,坐骨结节30处,足跟17处,尺骨鹰嘴15处,肩胛部9处,外踝7处,腓骨小头4处,胫前3处及腰部3处。褥疮形成时间2个月~11年。褥疮范围1.5cm×1.0cm^20.0cm×18.0cm。根据创面特点将褥疮分为窦道型12处、溃疡型74处和混合型93处。针对不同类型褥疮,分别采用中厚皮片、局部皮瓣或带血管蒂(肌)皮瓣修复。本组(肌)皮瓣切取范围5.0cm×3.5cm^26.0cm×14.5cm,皮片切取范围7cm×5cm^23cm×12cm。结果窦道型褥疮除1例伤口裂开,经再次缝合制动后愈合,余伤口均期愈合;皮瓣完全成活。溃疡型褥疮2例皮瓣远端1~2cm坏死,经换药后愈合,余中厚皮片与带血管蒂(肌)皮瓣均成活;伤口均期愈合。混合型褥疮局部皮瓣与带血管蒂(肌)皮瓣均成活;8处因囊壁或坏死组织切除不彻底,出现1~2处窦道,经对症处理后愈合;伤口均期愈合。供区创面均期愈合。73例患者术后获随访6个月,4例混合型褥疮复发,复发率为5.5%;余患者局部情况均良好。结论褥疮的临床分型有助于制定有针对性的手术治疗措施,提高治疗成功率。

高原地区不同海拔高度大鼠严重烫伤延迟复苏心肌组织内皮素-1与降钙素基因相关肽的变化

目的 探讨高原地区不同海拔高度(3 840 m,1 517 m)大鼠严重烫伤后延迟复苏心肌组织内皮 素-1(ET-1)和降钙素基因相关肽(CGRP)的变化特点。方法 雄性Wistar大鼠240只随机分为延迟复苏 组、即时复苏组和正常对照组,建立总体表面积30％的Ⅲ度烧伤模型,分别于伤后1、6、12、24、72和168 h取 材。应用放射免疫法检测心肌组织中ET-1和CGRP的含量。结果①延迟复苏组ET-1和CGRP均在伤 后6 h开始升高,ET-1在两个海拔高度与正常对照组相比分别增长了2.8倍和3.6倍,CGRP分别增长了 2.2倍和1.5倍(P均<0.01);但延迟复苏组ET-1和CGRP上升趋势明显低于延迟复苏组(P均<0.01)。 ②延迟复苏组ET-1在1 517 m自伤后6 h开始上升,至24 h达峰值,但在3 840 m于伤后72 h达峰值,增高 持续168 h;CGRP在1 517 m自伤后6 h明显上升,12 h达峰值,但在3 840 m高度于伤后72 h达峰值;在 3 840 m高度,ET-1／CGRP比值变化明显。结论 高原地区大鼠严重烫伤后随海拔升高,ET-1释放明显增 多,但CGRP升高速度缓慢,释放量明显降低,提示海拔越高,心肌保护物质消耗越多,ET-1／CGRP的调节 作用变化显著。

过氧化氢对肠上皮细胞线粒体编码基因mRNA的影响

目的 观察过氧化氢处理对体外培养肠上皮细胞株SW 480线粒体编码基因mRNA的影响。方法 以 40 0 μmol/L和 4mmol/L的过氧化氢处理人肠上皮细胞细胞株 (SW 480 ) 3h后 ,分离RNA ,应用RT PCR检测ATPase6、ATPase8、COI、COII及COIIImRNA的变化。结果 过氧化氢对肠上皮细胞线粒体编码基因mRNA的表达具有明显影响 ,但是这种改变不与过氧化氢的剂量呈现出一种一致的变化。

过氧化氢对肠上皮细胞线粒体的损伤作用

目的 观察过氧化氢对体外培养肠上皮细胞系SW 480线粒体的损伤作用。方法 以不同浓度的过氧化氢处理人肠上皮细胞株 (SW 480 ) ,观察细胞形态学和线粒体超微结构的改变。以MTT法测定线粒体整体功能的变化。应用DNA凝胶电泳和Annexin V及PI双标流式细胞术观察细胞凋亡的发生。应用免疫组织化学法检测细胞色素c的释放。结果 40 0 μmol L过氧化氢在 3h可引起线粒体整体功能的明显改变 ,但以后逐渐恢复。 4mmol L过氧化氢可引起线粒体整体功能不可逆的进行性下降 ;可引起线粒体空化 ,嵴肿胀。随着过氧化氢浓度的增加 ,线粒体的空化更加明显 ;可引起细胞发生凋亡。过氧化氢处理早期即出现细胞色素c的释放。结论 过氧化氢可引起肠上皮细胞线粒体明显损伤 。

皮肤恶性肿瘤97例临床分析

目的 :总结近十年来皮肤恶性肿瘤的发病特点与手术疗效。方法 :综合分析 1991年 3月～ 2 0 0 1年 4月收治的 97例皮肤恶性肿瘤患者的临床资料。结果 :鳞状细胞癌、基底细胞癌与恶性黑色素瘤三者共占本组病例的 85 5 7% ,且以5 0岁以上中老年人多发 ,前两种类型中 ,4 0岁以下患者占 17 6 5 %。 96例患者手术获得成功 ,并分别于术后 7个月～ 7年随访 5 6例 ,5例复发 ,其中 2例死亡。结论 :鳞状细胞癌、基底细胞癌和恶性黑色素瘤仍是近十年最常见的皮肤恶性肿瘤 。

骨髓间充质干细胞不同移植方式治疗大鼠糖尿病足溃疡的疗效观察

目的:探索骨髓间充质干细胞(bone-marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)经创缘皮下和小腿肌肉移植对大鼠糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcers,DFUs)的治疗效果。方法:全骨髓贴壁法体外培养雄性Wistar大鼠BM-MSCs至第3代,经4,6-联脒-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenylindole,DAPI)标记。48只雄性Wistar大鼠随机分成A组(BM-MSCs创缘皮下移植组,n=12)、B组(BM-MSCs小腿肌肉移植组,n=12)、C组(正常大鼠对照组,n=12)和D组(DFUs对照组,n=12)。大鼠糖尿病经腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导,在其双后足背切取一3 mm×7 mm矩形全层皮肤制成大鼠DFUs模型。于移植后第2,5,8,11天评估各组大鼠的创面愈合率,冰冻切片观察DAPI标记的BM-MSCs在创伤组织中的示踪,肉芽组织的厚度采用HE染色法检测,CD31和Ki-67的表达采用免疫组织化学法检测,血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在创伤组织中的表达采用ELISA和RT-PCR检测。结果:C组的创面愈合最快(P<0.05),第11天B组的创面愈合率大于A组(P<0.05)。第2天和第5天的冰冻切片观察发现B组的荧光强度及区域均大于A组。HE染色显示第5天B组的肉芽厚于A组。CD31的免疫组织化学显示第5天和第8天B组的小血管数目多于A组(P<0.05),而Ki-67的免疫组织化学结果显示两组无差异(P>0.05)。ELISA和RT-PCR的结果均显示第8天和第11天B组的VEGF表达水平高于A组(分别P<0.05,P<0.01)。结论:两种移植方式均促进了大鼠DFUs的愈合,但在愈合的后期,小腿肌肉内的移植方式体现出更好的持续性及高表达的VEGF,疗效更优。

糖尿病足溃疡大鼠模型的建立

目的建立一种稳定简单的糖尿病足溃疡大鼠模型。方法50只雄性Wistar大鼠随机分为对照组(10只)和造模组(40只)。造模组高脂喂养后腹腔注射链脲佐菌素(STZ),对照组注射等量缓冲液。监测两组空腹血糖、体质量、饮水量、尿量及股动脉血流变化。将两组大鼠足背部一矩形全层皮肤组织切除,建立糖尿病足溃疡模型,记录二组溃疡愈合时间。结果造模组比对照组大鼠血糖升高,体质量减轻,饮水量、尿量增加;造模3周后造模组双股动脉呈粥样化性改变,即血流频谱呈锯齿形,对照组血流正常;造模组溃疡愈合时间较对照组延迟(P<0.01)。结论该方法建立的糖尿病足溃疡大鼠模型操作简单,成功率高,溃疡面积可控,是稳定的糖尿病足溃疡模型。

高原地区大鼠严重烫伤延迟复苏血浆降钙素基因相关肽的变化

目的:探讨高原地区不同海拔高度大鼠严重烧伤后延迟复苏血浆降钙素基因相关肽(CGRP)的变化特点。方法:240只雄性Wistar大鼠建立严重烧伤模型(TBSA30%,Ⅲ度),随机分为延迟复苏组(DFR)、即时复苏组(IFR)和正常对照组(C),分别于伤后1、6、12、24、72h、7d取材。应用放射免疫法检测血浆中CGRP的含量。结果:在3800m海拔高度,IFR组血浆CGRP于伤后12h达最低点,DFR组于伤后6h达最低点;1500m海拔高度,IFR组与DFR组均于伤后12h达最低点,CGRP血浆含量明显高于3800m海拔高度者。两个海拔高度间,DFR组在伤后6h即出现显著差异(P<0.01),并一直延续至伤后24h,IFR组无显著性差异(P>0.05)。结论:高原地区大鼠严重烫伤后同一海拔高度,延迟复苏组血浆CGRP的含量低于即时复苏组;海拔越高,血浆CGRP的含量越低,延迟复苏后CGRP下降的越早。提示消耗的心肌保护物质越多,缺血缺氧越严重。