热休克转录因子1对视网膜色素上皮细胞抗氧化和抗衰老的调控作用

目的探讨热休克转录因子1(HSF1)对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)抗氧化和抗衰老的作用。方法利用成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除人ARPE-19细胞系中HSF 1基因,构建并获得2种HSF1缺失ARPE细胞株(ARPE/Hsf1-/-),分别命名为H8、H9细胞株。取野生型、H8和H9细胞株,应用DHE探针染色结合流式分析技术测定细胞内活性氧簇(ROS)含量,应用流式细胞分析方法测定细胞周期;采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定不同培养时间点细胞活力值;采用结晶紫染色实验测定细胞相对存活率;采用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色实验检测衰老细胞比率;采用Western blot法检测各细胞株中热休克蛋白(HSP)70、HSP27、聚集素(CLU)、p53、p21和白细胞介素(IL)-1β蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR法测定各细胞株中p53、p21、IL-6、IL-8、IL-1β、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)mRNA表达水平。比较各细胞株在不同热休克处理条件下和HSP90抑制剂IPI504处理下热休克反应相关蛋白相对表达量,比较各细胞株不同浓度H_(2)O_(2)处理后相对存活率,比较各细胞株经或未经ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理后p21蛋白相对表达量。结果基因测序显示H8和H9细胞株成功携带突变基因,Western blot检测结果显示H8、H9细胞株不表达HSF1蛋白,HSF1在ARPE-19细胞中被成功敲除。与野生型细胞株相比,H8、H9细胞株中的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);各细胞株HSP90蛋白相对表达水平总体比较,差异无统计学意义(F=0.29,P>0.05)。在不同热休克刺激和IPI504诱导下野生型细胞株中HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与野生型细胞株相比,H8和H9细胞株的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著低于相应处理的野生型细胞,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与野生型细胞株相比,H8和H9细胞株培养24、48、72和96 h的细胞活力均显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与野生型细胞株比较,H8和H9细胞株G1期细胞百分比显著升高,细胞周期抑制因子p53、p21的mRNA和蛋白相对表达水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05),SA-β-gal染色阳性细胞比率显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.001);衰老相关炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、MCP1 mRNA相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P<0.001)。H8和H9细胞株ROS含量明显高于野生型细胞株,差异均有统计学意义(均P<0.001);H8和H9细胞株经NAC处理后p21蛋白相对表达量较未经NAC处理明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。H8和H9细胞株200、400、600、800μmol/L H 2O 2处理条件下细胞相对存活率明显低于野生型细胞,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论敲除HSF1可下调HSP的表达,激活ROS/P53/P21通路,诱导RPE细胞衰老,并增加RPE对氧化应激刺激的敏感性。HSF1在RPE细胞中可能具有抗衰老和抗氧化调控作用。

面向对象的资源三号卫星影像分类研究

资源三号卫星影像数据目前广泛用于地形测绘、资源监测、地理国情监测等领域。本文主要针对资源三号卫星影像数据,以南京市玄武区为例,研究了适合国产高分辨率卫星影像的分类技术方法。分别采用面向对象的KNN分类方法和SVM分类方法对影像进行分类,并对分类结果的精度进行了分析和评价。研究结果表明,在对遥感影像采用合适的分割尺度进行分割后,采用基于面向对象的SVM分类方法得到的结果,其总体分类精度为90.72%,Kappa系数为86.64%,远高于采用基于面向对象的KNN分类方法得到的结果。因此,面向对象的SVM分类方法更适合于资源三号卫星影像的分类。

南方复合地貌区DEM内插算法的对比研究

数字高程模型是数字地形分析的重要数据基础,在土壤、水文、地貌、生态环境、地质灾害、农业等领域均有广泛应用。插值生成的DEM精度与插值算法本身特性、插值区域地貌类型都密切相关,研究插值算法对不同地貌类型的拟合精度差异,对提高DEM插值精度具有重要意义。以平原丘陵兼有、水网密集分布的南方复合地貌区为研究区,对ANUDEM,IDW,Kriging,Spline,NNI,TIN六种插值算法生成的DEM分别从总体、丘陵岗、平原3方面进行误差评价,结果表明:在丘陵岗地区,ANUDEM精度最高,对地形因子拟合程度最为准确;在平原地区,ANUDEM,TIN精度较高,能准确刻画水网等细节信息;总体而言,ANUDEM插值生成的DEM更能够精确地模拟南方复合地貌区的真实地形。

小学高年级学生口头表达存在的问题以及改进措施

口头表达能力是学生必不可少的一项技能。笔者通过观察发现,小学高年级段的学生的口语表达能力薄弱,不会主动表达。本文针对存在的问题进行分析,并且就如何改进问题谈一谈自己的思考:转变教师观念,重视口头表达;活用课堂教学,丰富锻炼形式;运用多种形式,激发学生兴趣;加大家校合作,提升教育合力。

过表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2型刺突蛋白抑制人视网膜色素上皮细胞生长

目的观察过表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)刺突蛋白(S-蛋白)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞生长的抑制作用。方法构建SARS-CoV-2S-蛋白基因片段表达质粒(p3xflag-S),并转染至ARPE-19、HEK293细胞内,应用DNA测序进行鉴定,并对表达的标签蛋白进行蛋白免疫印迹法(Western blot)检测。HEK293细胞分为细胞1、2、3、4,分别转染GFP11质粒和空载质粒、GFP1-10质粒和空载质粒、GFP11质粒和pCMV-HA-ACE2质粒、GFP1-10和p3xflag-S质粒。将细胞1与细胞2(对照组1)、细胞2与细胞3(对照组2)、细胞3与细胞4(观察组)、细胞1与细胞2、3、4(对照组3)混合共培养。明场显微镜和荧光显微镜观察细胞融合情况。将RPE细胞分为对照组、过表达S-蛋白组。流式细胞仪检测RPE细胞周期;计数试剂盒8(CCK-8)检测RPE细胞增生水平;Western blot检测RPE细胞中S-蛋白表达水平。组间比较行最小显著差法t检验。结果DNA序列测定结果显示,S-蛋白cDNA与标签蛋白融合;Western blot检测结果显示,与未转染p3xflag-S质粒的细胞比较,转染HEK293细胞中S-蛋白相关表达量升高。明场显微镜下可见大而多核的融合细胞团;荧光显微镜下可见融合细胞内有多个细胞核且呈明显绿色荧光。Western blot检测结果显示,与未转染p3xflag-S质粒的RPE细胞比较,转染p3xflag-S质粒的RPE细胞中S-蛋白相关表达量升高。CCK-8增生分析结果显示,与对照组比较,过表达S-蛋白组RPE细胞增生能力显著降低,差异有统计学意义(t-22.70、16.75、23.38,P<0.0001)。流式细胞仪检测结果显示,对照组、过表达S-蛋白组G1期细胞分别为41.1%、67.0%;与对照组比较,过表达S-蛋白组G1期细胞明显升高,差异有统计学意义(t=4.76,P=0.018)。过表达S-蛋白组细胞凋亡率较对照组明显增加,差异有统计学意义(t=4.91,P=0.008)。结论过表达SARS-CoV-2S-蛋白可抑制RPE细胞生长活性。