一种改良的Dot-ELISA法

改良的Dot-ELISA法,即将点好抗原的NC膜固着于PVC浅孔软板内进行试验。本文以血吸虫卵抗原、肺吸虫成虫抗原、华枝睾吸虫成虫抗原、细粒棘球蚴囊液抗原等4种抗原膜,用改良的Dot-ELISA法,对血吸虫病、肺吸虫病、华枝睾吸虫病、细粒棘球蚴病患者血清各15例以及正常人血清33份进行试验。结果表明:各种抗原与其对应的血清反应在适宜的比例中阳性率可达93％～100％。假阳性率3％。这种改良的Dot-ELISA法,简便易行,可望发展成为一种适用于现场开展多种寄生虫调查的药盒。

细粒棘球蚴实验感染鼠体液免疫动态的初步结果

采用胶乳凝集试验(LA)、酶联免疫电转移印斑试验(EITB)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点-ELISA试验(Dot-ELISA)以及免疫荧光试验(IFA)5种免疫血清学方法,对细粒棘球蚴实验感染鼠的抗体进行了动态观察,结果表明这5种检测方法均能检出抗体,其中以Dot-ELISA及IFA最敏感,于感染后2周即有部分鼠测到抗体。ELISA、EITB和LA出现阳性反应的时间依次为4周、2月和3月。感染8月及1年的病鼠全部阳性,而对照鼠则全部阴性。

中国大陆日本血吸虫品系的研究 X.成虫蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

对中国大陆的安徽、湖北、广西、四川和云南5地日本血吸虫成虫蛋白质组分进行了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和比较,结果表明各地虫体蛋白质电泳图谱基本相似,但作银染分析时,广西地区两性虫体的蛋白条带则呈现某些差别。

中国大陆日本血吸虫品系的研究——Ⅷ.感染动物血清免疫学反应

本文观察了安徽、湖北、四川、云南、广西5地日本血吸虫感染小鼠、大鼠、金黄仓鼠、兔、恒河猴等5种动物的血清对同源及异源虫卵的环卵沉淀试验(COPT)反应状况以及应用安徽虫卵制备的可溶性抗原进行胶乳凝集试验(LAT)及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测同源或异源虫体所致的血吸虫病的抗体情况,未见应用同源虫卵抗原检测感染动物的结果显著地优于异源的。这提示在中国大陆应用异地血吸虫卵抗原进行上述血清免疫学反应检测时似不影响其阳性检出率。

我国4省、自治区细粒棘球绦虫DNA限制性片段长度多态性分析

运用 DNA探针pHD5、pEG18、pSM889 结合 Southern blot 杂交技术对采自我国新疆、青海、甘肃和宁夏等地的羊源细粒棘球蚴与采自青海、甘肃的牦牛源细粒棘球蚴进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析。结果表明我国这些省、自治区采集的羊源细粒棘球蚴彼此之间未见有明显而稳定的杂交条带差异,属于同一虫株。青海和甘肃两省牦牛源细粒棘球蚴彼此之间也未见明显而稳定杂交条带差异,据杂交图谱判断似与羊源细粒棘球蚴属同一虫株。

多房棘球蚴病特异性诊断抗原Em18的基因克隆、表达和血清学评价

目的 克隆从我国四川省分离的多房棘球绦虫Em18抗原基因片段 ,表达重组抗原 ,用于多房棘球蚴病(AE)的诊断 ,并用患者血清对其诊断价值进行评价。 方法 PCR扩增目的基因片段与质粒载体 pET2 8a (+ )连接构建表达质粒 ,转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 )菌株表达重组蛋白 ,用镍 次氮基三乙酸琼脂糖树脂 (NI NTAagarose)亲和层析纯化重组抗原 ,酶联免疫吸附测定 (ELISA)评价重组抗原的血清学诊断效果。 结果 获得两个高效表达克隆ReEm18 1和ReEm 18 2。其中ReEm18 1与预期序列一致 ,ReEm18 2为同一序列 ,但有 2 7bp的核苷酸缺失。两个克隆表达的融合蛋白相对分子质量 (Mr)分别为 2 80 0 0和 2 60 0 0。对 10 1例AE、 47例细粒棘球蚴病、3 0例囊尾蚴病、 10例肝癌、 9例血吸虫病和 40名健康人共 2 3 7份血清进行ELISA检测 ,结果显示 ,ReEm18 1和ReEm 18 2重组抗原对AE血清诊断的敏感性为 86 1%和 90 1%、特异性为 93 4%和 94 1%、阳性预期值为 90 6%和 91 9%、阴性预期值为 90 1%和 92 8%、诊断效率分别为 90 3 %和 92 4% ;对 5 8例AE患者肝脏病灶大小与重组抗原检测血清平均吸光度 (A )的相关性比较分析结果表明 ,抗体反应水平在病程早期有较好的相关性。

从平行检测和监测结果分析我国血吸虫病诊断试剂的现状

由卫生部批准，世界银行贷款血吸虫病控制项目联合科研管理委员会（ＪＲＭＣ）提供经费资助的全国血吸虫病免疫诊断检测中心，于１９９５年成立。该中心依托于中国预防医学科学院寄生虫病研究所。任务之一是对国内现有血吸虫病诊断试剂进行监测和评估，以期对现有诊断试剂...

斑点金免疫渗滤法在检测囊虫抗体中的应用

目的 将斑点金免疫渗滤法用于检测囊虫抗体 ,以制备囊虫病诊断试剂盒。方法 经透析的猪囊尾蚴囊液作为检验抗原 ,对 71份囊虫病患者、90份正常人和 2 0份其他病患者血清进行了斑点金免疫渗滤法检测并与酶联免疫吸附法比较。结果 斑点金免疫渗滤法的敏感性为 90 .1% (6 4 / 71) ,特异性为 95 .6 % (86 / 90 ) ,其他病患者血清反应中仅 1例脑肿瘤患者血清阳性 ,其余为阴性。斑点金免疫渗滤法和酶联免疫吸附法的符合率为94 .4 % (15 2 / 16 1)。

抗血吸虫成虫表膜抗原单克隆抗体检测循环抗原及/或免疫复合物的实验研究

本文报告用单克隆抗体检测血吸虫感染兔血清中循环抗原及/或免疫复合物的实验结果.以血吸虫成虫盐水浸液抗原ACSE免疫BALB/c小鼠,取其脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞融合获得抗成虫表膜的单克隆抗体8SE_4。此抗体经DE_(52)柱层析提纯后制成HRP-8SE_4结合物.血清样本与HRP-8SE_4作用后加入PEG(mw·6000)沉淀免疫复合物,然后加入底物OPD显色,于492nm读数,OD值即反映血循环中抗原及/或免疫复合物的量。实验结果表明5只重感染兔(接种尾蚴15O0～2000条)于感染后6wk可见OD值明显升高,达到感染前的1.9～4.5倍。5只轻感染兔接种尾蚴10～500条亦于感染6wk后OD值明显上升,至感染后8wk达高峰,此后至11wk剖杀时仍维持在较高水平.5轻感染兔检虫数为4～326条,未见虫荷与检测结果有明显相关。本实验结果提示感染兔血清中有循环表膜抗原及/或其复合物存在。至于检测该抗原能否用于考核治疗效果,有待进一步研究。

细粒棘球蚴AgB亚单位抗原基因的克隆和表达系统的优化

目的从我国细粒棘球绦虫分离株(新疆源和甘肃源)中克隆AgB1和AgB2两个亚单位基因,并试用不同的表达载体对两个AgB亚单位基因的表达情况进行比较观察。方法设计特异性引物,扩增AgB1和AgB2亚单位抗原基因,分别用pET28a(+)、pET32a(+)和pGEX4T-13种表达载体构建重组质粒,对AgB亚单位基因在不同载体中的表达情况进行比较。结果从我国细粒棘球绦虫分离株中克隆的AgB1和AgB2抗原基因与GenBank中的序列比对,AgB1与德国人源、巴西羊源、意大利牛源均有一定的核苷酸和氨基酸差异;AgB2与乌拉圭羊源序列完全一致。在3种载体中表达重组蛋白的结果显示,不同载体和表达系统对重组表达蛋白的生物活性和可溶性有较大的影响。结论成功地克隆了细粒棘球蚴AgB亚单位基因,AgB1和AgB2基因在3种不同表达载体中的表达情况及对融合标签蛋白的血清基础反应性的比较分析表明,两个重组抗原在pET32a载体中的表达优于pET28a和pGEX4T-1载体。

棘球蚴病患者IgG抗体阴性反应血清再检测的研究

目的 探索棘球蚴病患者抗体应答假阴性反应原因 ,以改进棘球蚴病的免疫诊断方法。 方法 采用间接ELISA和双抗体夹心ELISA方法 ,检测 42例IgG抗体阴性反应棘球蚴病患者血清的IgG亚类 (IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 )、IgA、IgM、IgE抗体及抗原和循环免疫复合物。 结果 42例阴性血清中 ,32例IgG亚类或IgA、IgM、IgE抗体阳性 ,1 0例血清抗体全部阴性。其中IgG1、IgG4及IgA、IgM、IgE的检出率明显高于正常人 ,分别为 42 .9%、1 1 .9%、2 8.6 %、2 6 .2 %和 2 1 .4 %。小儿的IgM高于成人。肝棘球蚴病患者的IgG亚类高于肺棘球蚴病患者。IgG1与其它抗体联合检测 ,以IgG1 +IgA +IgM检出率最高 ,为 64 .3 %。IgG阴性患者血清的CAg和CIC阳性率分别为 2 8.57%及30 .95 %。 结论 抗棘球蚴总IgG抗体表达水平低下 ,抗体表达种类不同及循环免疫复合物的形成 ,是造成棘球蚴病患者IgG抗体反应阴性的主要原因。IgG1 +IgA

从小鼠的继发性细粒棘球蚴中分离生发细胞

小鼠的继发性细粒棘球蚴囊组织,经用0.25％胰蛋白酶溶液消化和密度梯度离心,可获得分离的生发细胞。此种细胞在含20％小牛血清的RPMI1640中培养约7d后开始增殖,增殖后的细胞表面光滑,形体增大。免疫学检测显示生发细胞的表面及其可溶性蛋白中有抗原成分。将培养的生发细胞返种至小鼠腹腔中时,少数可发育成囊。

核糖体28S-D3等位基因特异扩增鉴别微小按蚊亲缘种A和C

目的 建立微小按蚊复合体不同亲缘种A和C的分子鉴别方法。方法 用单蚊蚊腿消化提取基因组DNA ,PCR特异扩增 2 8S第 3结构域 (D3 )基因 ,对PCR产物进行纯化、克隆、测序和序列分析 ;基于序列差异设计特异引物 ,进行等位基因特异扩增 (PCR -ASA) ,根据扩增片段大小区分微小按蚊不同亲缘种。结果 发现微小按蚊不同亲缘种A和C(GeneBank登录号 :AF416782 ,AF42 5 5 94) ,根据二者序列差异设计的特异引物能在普通琼脂糖凝胶上直观地区分两亲缘种 ,两者除在 3 76bp处有一共同条带外 ,分别在 2 94bp和 112bp处出现各自的特异扩增带。结论 我们建立的ASA分子鉴别方法能有效地将我国微小按蚊不同亲缘种A和C区分开来。

抗人IgG_4单克隆抗体用于ELISA法检测血吸虫病患者血清特异性IgG_4抗体的观察

文献报道［１，２］血吸虫病患者重复感染与特异性ＩｇＧ４抗体水平有关，患者经有效治疗后，特异性ＩｇＧ４抗体维持在高水平，其重复感染率较特异性ＩｇＧ４抗体正常组为高。国内有关这方面的观察报道不多，为了对日本血吸虫病患者的特异性ＩｇＧ４抗体水平有一初步了解...

日本血吸虫性别与循环抗原检出的关系

本研究用单性尾蚴感染家兔，追踪观察循环表膜抗原检出情况。结果９只雄性尾蚴感染兔（检虫１５—１３３条，平均５３．１条）及９只雌性尾蚴感染兔（检虫１—１０２条，平均３６．１条）用斑点－ＥＬＩＳＡ法定期检查１年，循环表膜抗原始终为阴性。而７只复性感染兔（检虫４－１６１条，平均６７．１条）于感染后６—１０ｗｋ先后出现斑点－ＥＬＩＳＡ阳性反应。单性雌虫在家兔体内发育不良，呈螺旋状，其寿命至少１年。单性雄虫则可发育成熟，虫体肥厚、粗壮。

棘球蚴特异性抗原的蛋白质印迹分析

目的 寻找细粒棘球蚴 (Eg)和多房棘球蚴 (Em)特异性抗原组分用于免疫诊断。 方法 对Eg、Em的囊液、原头节、囊壁角质层、囊壁生发层及犬泡状带绦虫、犬豆状带绦虫、羊细颈囊尾蚴、猪囊尾蚴等 4种异源性绦虫 ,共14种粗抗原进行免疫学分析。采用蛋白质印迹试验 (Westernblotting)、Genesnap和Genetool分析软件比较分析不同抗原蛋白条带分别与囊型棘球蚴病 (CE)及泡型棘球蚴病 (AE)患者血清反应的差异。 结果 14种粗抗原中与CE、AE患者血清发生交叉反应的 11条蛋白条带相对分子质量 (Mr)为 13 0 0 0 0、10 0 0 0 0、940 0 0、80 0 0 0、75 0 0 0、660 0 0、62 0 0 0、5 2 0 0 0、3 80 0 0、3 2 0 0 0及 2 40 0 0 ;与CE患者血清有特异性反应的 5条蛋白条带Mr为 410 0 0、40 0 0 0、2 2 0 0 0、160 0 0和12 0 0 0 ;与AE患者血清具有特异性反应的 8条蛋白条带Mr为 12 0 0 0 0、10 90 0 0、860 0 0、5 90 0 0、43 0 0 0、2 80 0 0、2 0 0 0 0及 180 0 0。 结论 确定了Eg和Em共有的交叉反应性抗原和具有进一步研究价值的特异性抗原组分 。

细粒棘球绦虫基因库的构建

细粒棘球绦虫DNA经Sau3AI部分水解,并用电洗脱方法从琼脂糖凝胶中回收15-23kb大小的片段。得到的片段与λ噬菌体置换载体EMBL3 DNA重组,采用体外包装系统构建了细粒棘球绦虫的基因库,获得了1.2×10~6个重组子。通过与探针的分子杂交,从库中分离到6个细粒棘球绦虫γDNA基因的阳性克隆。

斑点-ELISA法在肺吸虫病诊断中的应用

自1986年我们报告用斑点-ELISA法诊断血吸虫病以来,该法往国内已应用于黑热病、华支睾吸虫病、疟疾、包虫病等的诊断,都获得较为满意的结果。认为该法具有敏感、特异、简单易行、试剂用量少。

PCR-RFLP鉴别微小按蚊亲缘种A和C

目的 建立微小按蚊复合体不同亲缘种A和C的分子鉴别方法—PCR产物酶切片段长度多态性分析 (PCR RFLP)。 方法 用单蚊蚊腿消化提取基因组DNA ,PCR特异扩增核糖体 2 8S第 3结构域 (D3 )基因 ,对PCR产物进行纯化、克隆和测序 ;分析微小按蚊A和CD3基因的酶切图谱 ,选择合适的限制性内切酶对两者PCR产物进行特异性切割 ,按照酶切片段长度区分两亲缘种。 结果 微小按蚊A被限制性内切酶MboII切割后在约 3 76bp、2 68bp和 10 8bp处出现 3条条带 ,而微小按蚊C因第 96bp、97bp位点突变 ,不存在限制性内切酶MboII的特异识别位点而未被消化 ,仅在 3 76bp处存在唯一条带。 结论 本实验建立的PCR RFLP分子鉴别方法能有效地将形态难以鉴别的微小按蚊亲缘种A和C(GenBank :AF416782 ,AF415 5 94)区分开来。