人原代呼吸道上皮细胞培养及抗呼吸道合胞病毒活性

为建立人原代呼吸道上皮细胞(Human airway epithelial cell,hAEC)的培养方法,并在hAEC体系上探讨3-硫代吲哚类化合物RSV-A-4和免疫抑制剂代谢产物6-MMPr的抗呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)活性及其机制,从而构建可用于RSV药物筛选及药效评价的细胞模型。采集人呼吸道上皮细胞样本,分离细胞后建立hAEC的培养方法,并进行细胞形态和活力鉴定;在hAEC体系上检测小分子化合物RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性及其细胞毒性;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与Time-of-addition assay技术,探讨RSV-A-4和6-MMPr的抑制RSV复制的作用机制。培养的hAEC经鉴定:其体外培养存活率可达93.51%;RSV-A-4和6-MMPr的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))分别为(207.30±4.77)μmol/L和(3191.00±6.11)μmol/L,6-MMPr的半数细胞毒性浓度(Half maximal cytotoxic concentration,CC_(50))为(95526.00±10.97)μmol/L,而RSV-A-4对hAEC未见明显细胞毒性;RSV-A-4和6-MMPr均在RSV病毒基因组复制阶段抑制RSV复制。成功建立可用于抗RSV药物筛选及体外评价的hAEC培养体系,RSV-A-4和6-MMPr在细胞水平均能有效抑制RSV复制。

T7 RNA聚合酶的克隆及其介导基因转录功能的鉴定

目的构建含T7RNA聚合酶(T7RNA Polymerase,T7RNP)的真核表达载体,同时构建含T7启动子、增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和T7RNP转录终止信号的载体,并通过观察EGFP的表达推测T7RNP表达和T7表达系统介导基因转录的功能。方法根据编码T7RNP的基因序列,应用PCR技术从含有T7RNP基因的E.coli BL21(DE3)基因组中扩增编码T7RNP的基因片段,克隆至载体pcDNA3·1(+)。同时从px8δt载体和pGEM-Teasy/EGFP上切下T7RNP识别的终止信号(terminator,TER)和编码EGFP的基因,克隆至载体pcD-NAII。将获得的两个重组质粒共转染BHK细胞。48h后,通过观察EGFP基因在真核细胞内的表达情况,推测T7RNP基因的表达及表达后识别T7启动子介导基因转录功能。结果成功构建了含T7RNP编码基因的真核表达载体pcDNA3·1(+)/T7RNP和原核表达载体pcDNAII/EG-FP/TER,共转染BHK细胞后,可观察到EGFP表达的绿色荧光。结论T7RNP能顺利在真核细胞内表达,并通过与T7启动子和TER的相互作用,成功实现了EGFP基因的转录和表达。

人呼吸道合胞病毒RNA聚合酶复合体蛋白N、P的表达鉴定

本研究根据编码A亚型人呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialVirus,HRSV)核壳体蛋白(Nucleocapsidprotein,N)和磷蛋白(phosphoprotein,P)的基因序列,各设计一对特异性的引物,应用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得n和p的基因片断,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)。获得的重组质粒通过脂质体Lipofectamine2000转染COS-7细胞,72h后再用Westernblot鉴定蛋白的表达。结果显示真核表达载体pcDNA3.1(+)/N和pcDNA3.1(+)/P的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变,利用蛋白印记方法也检测到了N和P的特异性条带。于是我们认为成功构建了含有HRSVN和P编码基因的真核表达载体,在真核细胞内能顺利表达。为进一步开展HRSV反向遗传学等研究奠定了基础。

可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备

构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11,鉴定正确后,克隆至HDAd质粒pSC15B,构建pSC15B/F HDAd重组质粒,PmeⅠ消化pSC15B/F去除原核复制元件及抗性基因,获得HDAd/F DNA分子,经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞,16h后感染辅助病毒,收获HDAd/F载体粗提液,随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限,同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。与辅助病毒共感染293Cre4细胞进一步扩增HDAd/F、CsCl梯度法超速离心制备大量纯化的HDAd/F载体,体外感染293细胞,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。总之,成功构建HDAd/F载体并在真核细胞中实现表达,为体内免疫学效力试验奠定基础,为研制RSV疫苗提供了一种新方法。

G9型人A组轮状病毒LL52696与LL52727株的主要基因及其编码蛋白特征的分析

Two Rotavirus G9P[8] strains (LL52696 and LL52727) were recognized during a sentinel-based survey in Lulong, China. Phylogenetic analysis of the VP7 gene showed that both strains isolated constituted a divergent genetic cluster distinct from the other G9 strains isolated in China. Analysis of VP4, VP6, and NSP4 genes revealed that these strains were closely related to Lulong strains. We hold that two strains were reassortant between G9 and Lulong predominant strains.

人呼吸道合胞病毒疫苗研发的突破及挑战

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)已被发现60余年。在经历了20世纪60年代RSV疫苗研发失败后,基于融合前融合糖蛋白(prefusion fusion glycoprotein,preF)的RSV结构性疫苗目前已取得突破性进展,通过接种孕妇和60岁以上老年人群,为新生儿及老年人群提供有效保护,从而解决了预防RSV感染“无苗可用”的历史难题。2023年是RSV疫苗研发的里程碑,也将成为新的起点。在此背景下,本文系统介绍了RSV疫苗研发进展、面临的挑战及今后的发展方向,提出针对RSV不同易感人群应采用不同疫苗形式的科学依据及对策,并对RSV感染重点人群(如血清学阴性婴幼儿等低龄儿童)的疫苗研发难点及候选疫苗形式进行了全面分析。结合基于RNA病毒反向遗传学技术的RSV减毒活疫苗(live-attenuated vaccine,LAV)研发设计、临床试验数据及黏膜疫苗优势,笔者认为RSV LAV是预防6个月及以上婴幼儿和低龄儿童RSV感染的前景较好的候选疫苗,有望为RSV疫苗研发带来新突破。此外,本文就如何加强我国RSV疫苗研发提出建议。

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定

目的克隆人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)F基因,构建F基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/F,并进行表达和鉴定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,通过RT-PCR从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得F蛋白的基因,然后克隆到pGEM-3zf载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),行酶切鉴定,脂质体法转染COS-7细胞,应用Western blotting方法分析F基因表达情况。结果测序证实得到HRSV F基因序列,序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,利用Western blotting方法检测到了F蛋白的特异性条带。结论成功克隆HRSV F基因,并在真核细胞中获得表达。

真核表达人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法

目的真核表达人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F),并完成蛋白纯化及纯度测定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,PCR方法扩增出3′端带His标签的F基因序列,克隆入pGEM-T-easy载体,经核酸序列分析后,进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体,限制性内切酶鉴定,用脂质体Lipofectamine 2000转染COS-7细胞,72h后再用Western blot检测目的蛋白的表达。Ni柱亲和层析纯化COS-7细胞表达的F蛋白,高效毛细管电泳分析纯化后蛋白纯度。结果核酸序列分析证实获得带His标签的RSVF基因序列,没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,利用Western blot方法检测到F蛋白的特异性条带,纯度达99%以上。结论初步建立了真核表达RSVF蛋白的纯化方法,为进一步优化RSVF蛋白制备条件及单克隆抗体及诊断试剂等研究奠定了基础。

人呼吸道合胞病毒M蛋白非复制型重组腺病毒的构建和鉴定

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)基质蛋白(matrix protein,M)在RSV形态发生上具有重要作用,因含有CTL及CD4+T细胞抗原表位,在疫苗研究上具有一定意义。为此,应用RT-PCR方法从感染RSV的HEp-2细胞中扩增获得M蛋白基因,构建了含M基因的非复制型重组腺病毒并进行表达和鉴定。基因序列分析显示RSV M基因仅有一处碱基发生错义突变。获得的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM感染293细胞,观察到细胞出现CPE,RT-PCR发现M基因有转录,Western blotting及间接免疫荧光分析检测到M蛋白。成功克隆A亚型RSV Long株M基因,并获得一株可表达A亚型RSV M蛋白的非复制型重组腺病毒FGAd/RSVM,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。

人双埃可病毒的流行及其疾病相关性

人双埃可病毒（human parechovirus，HPeV）最早于半世纪前被发现，起初被归为肠道病毒属，命名为埃可病毒22和23，但由于基因结构、进化关系及生长特性与肠道病毒属的其他病毒不一样而划分为新的双埃可病毒属，并重新命名为HPeV1与HPeV2。随着RT—PCR与病毒发现方法的广泛应用，不同型别的HPeVs陆续被报道。

2008年11月至2009年1月广东省5岁以下儿童其他感染性腹泻异常增高的病原学研究

From November 2008 to January 2009,a sharp increase of diarrhea in children in Guangdong province appeared,we randomly collected 53 stool specimens from out-patient children with dirrhea in 3 major hospitals (Guangzhou City Children’s Hospital,Shenzhen Baoan District Maternal and Child Health Hospital,First Affiliated Hospital of Shantou University). Rotavirus and calicivirus were screened by ELISA and RT-PCR. We found 29 cases of rotavirus infection with diverse serotypes. Only four cases were identified as calicivirus infection. The result indicated that rotavirus was a major pathogen of this high incidence of diarrhea from November 2008 to January 2009 in Guangdong Province.

腹泻住院患儿中检测到人双埃可病毒

目的在腹泻住院患儿粪便标本中检测人双埃可病毒（HPeV），探讨HPeV与婴幼儿重症腹泻之间的联系。方法通过Real—timePCR直接从〈5岁未知病原住院腹泻患儿粪便标本中检测HPeV，进而通过基于VP3／VP1连接区的巢式PCR扩增片段的测序结果进行分型。结果99份腹泻粪便标本，HPeV阳性24例（24％），其中，以HPeV1为主（50％），其次为HPeV3（25％），HPeV4（8．3％），HPeV6（4．2％），还有3例HPeV阳性标本未能分型，未检测到HPeV2、5、7、8。HPeV感染的住院腹泻患儿主要为〈1岁患儿。HPeV感染高峰为秋冬季节，10月达到峰值。VP3／VP1连接区基因与已知HPeV参考株氨基酸序列同源性均〉98％。结论在中国开展HPeV监测对于进一步阐明我国婴幼儿腹泻的病因构成及深入了解HPeV的病原学及流行病学特点有重要意义。

中国河北省卢龙地区猪札如病毒的基因多样性

Porcine sapoviruses (SaVs),which belong to the family Caliciviridae,have been considered potential zoonotic agents for human infection,and several cases have been reported in Asian countries. In this study,a total of 200 porcine fecal samples collected from Lulong county of China were tested. Among 200 samples,porcine sapoviruses were detected by RT-PCR in 17 samples (8.5%) showing their circulation in China. 14 out of 17 positive sapovirus strains were genetically related to the genogroup III (GIII) and were further divided into three different clusters or genotypes according to the phylogenetic analysis. In addition,the remaining three sapovirus strains belonged to GVII (one strain) and a potential novel genogroup (two strains) according to the phylogenetic analysis and the nucleotide identity and amino acid identity. These data suggested the genetic diversity of porcine sapoviruses in China.

一起由水污染引起的儿童及成人A组轮状病毒腹泻暴发

目的确定2006年11月广西大新县大范围腹泻暴发性流行的病原及其分子生物学特点。方法进行流行病学个案调查和粪便标本的实验室检测，用ELISA试剂盒进行A组轮状病毒的检测，对检测阳性标本进行轮状病毒分型并对其中4份检测阳性轮状病毒的vP7全基因扩增。结果采集的64份腹泻患者粪便标本中共有30份检测为轮状病毒阳性，总阳性率为46．9％，此次暴发的流行病学和临床特征也符合轮状病毒腹泻特征，RT-PCR进行G／P分型显示为GIP[8]型轮状病毒，VP7氨基酸显示第68位氨基酸改变。结论GIP[8]型A组轮状病毒是此次腹泻暴发的病原。值得注意的是，此次A组轮状病毒暴发累及儿童和成人。

中国广西龙虎山野生猕猴粪便的病毒宏基因组学分析

非人灵长类携带的病毒种类繁多,其中部分对人具有致病性。为深入了解我国野生猕猴携带病毒的状况,本研究应用MiSeq高通量测序及生物信息学分析技术,对从广西采集的280份猕猴粪便标本进行了病毒宏基因组学的分析。高通量测序共获得了233 726 79条读长(Reads),其中4641条序列与病毒相关,进一步注释到27个病毒科(包含细小病毒科中的细小病毒亚科和浓核病毒亚科),包括其中5种脊椎动物病毒(占78.2%)、6种昆虫病毒(占5.5%)、11种植物病毒(占10.4%)、其他的病毒(占9.8%);遗传进化分析结果显示,被注释为萨佩罗病毒、肠道病毒、细小病毒、腺相关病毒等序列与已知病毒相似,部分序列呈现明显的差异;应用PCR扩增进一步证实了病毒序列的真实存在。本研究初步确定了广西地区猕猴粪便中病毒的病毒谱,为深入分析和研究其中有潜在公共卫生意义的病毒奠定了基础。

诺如病毒河北卢龙株NHBGR59全基因组序列分析

目的 分析河北卢龙县腹泻儿童粪便标本中存在的诺如病毒株NHBGR59的全基因组序列，了解其基因结构特点和进化特征。方法根据454高通量测序获得的两个重叠群（contig）和诺如病毒参考株序列（GenBank登录号KM198534）设计NHBGR59特异性引物，用重叠反转录聚合酶链反应（ReversetranscriptionPCR，RT—PCR）和cDNA末端快速扩增的技术（rapid—amplificationofcDNAends，RACE）的方法扩增其全长基因，经过分子克隆、测序获得全基因组序列，然后进行三个开放阅读框（OpenReadingFrames，ORFs）序列和系统进化树的分析。结果诺如病毒河北卢龙珠HBGR59病毒全基因组全长为7563bp（除了PolyA尾），病毒基因组分为三个ORFs：ORF1（5～5098nt）、ORF2（5079—6731nt）和ORF3（6731～7510nt），其中ORFl和ORF2之间有20bp重叠，ORF2和ORF3之间有lbp重叠。经过全基因组序列分析发现其和基因组II基因型6（genogroupIIGenotypeVI，GII．6）诺如病毒株30443同源性最高（同源性为98．O％）。ORF2以及ORF3核苷酸和氨基酸序列与株30443同源性最高（分别为97．0％，98．0％；99．0％，98．0％）。ORFI的基因和氨基酸序列与台湾暴发的急性胃肠炎GII．6株11-FJ-5（GenBank号KM461694）同源性最高（99．0％，99．3％），只在高突变P2区发生一个氨基酸突变位点：aa308D—N；其中衣壳区的氨基酸序列与其他GII-6型诺如病毒相似度为73．0％～99．3％。进化树分析发现河北卢龙株HBGR59与GII．6型株30443和11-FJ-5亲缘关系最近。结论河北卢龙株HBGR59为诺如病毒GII．6型，进化关系上与已报道的GII.6型株30443和11-FJ-5最近。

人A组轮状病毒VP6和NSP4编码基因的独立进化

轮状病毒是引起儿童重症腹泻的主要病原。目前，绝大多数研究认为A组轮状病毒的VP6和NSP4基因在进化上紧密联系^[1]。我们曾报道过一株在世界上极为罕见的人A组轮状病毒G5P[6]毒株^[2]（LL3354），通过对该毒株的VP6和NSP4全基因的分析。发现LL3354的VP6和NSP4编码基因是通过独立进化而来。

GIV诺如病毒荧光定量一步RT-PCR方法的建立

目的 建立灵敏、特异的GIV诺如病毒的荧光定量检测方法.方法 合成针对GIV诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,根据我国新发人GIV诺如病毒序列（GenBank序列号：KC894731）构建荧光定量检测的RNA标准品,对其灵敏度、特异性、重复性进行评估,以传统逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）的方法作为参考评价.结果 该方法检测的灵敏度可以达到1.0×102拷贝/μl,检测范围为102 ～ 108拷贝/μl;与GⅠ、GⅡ诺如病毒、肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒等无交叉反应;批内和批间重复性实验的循环阈值（Ct）变异系数（CV）分别小于1.31％和3.68％;在阳性粪便标本的对比检测中发现,该方法与普通RT-PCR相比具有灵敏度高、能够定量的优势.结论 本研究建立的检测GIV诺如病毒的荧光定量一步RT-PCR法,可应用于G1V诺如病毒的检测.

广西猕猴中发现GⅡ.17型诺如病毒及其全基因组序列分析

目的 了解广西省龙虎山猕猴粪便标本中的GⅡ.17型诺如病毒的流行情况、基因结构和进化特征.方法 2015年3月～8月收集400份野生猕猴粪便标本,利用建立好的HISEQ高通量测序技术在粪便标本中发现了GⅡ.17型诺如病毒,命名为GX213.采用反转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）技术对其进行了序列鉴定、全长扩增和检测研究,并对三个开放阅读框（Open reading frames,ORFs）进行了序列和遗传进化分析.结果 筛查结果显示阳性率为0.5％ （2/400）.诺如病毒GX213毒株基因组全长为7 565 bp（包括PloyA尾）,其基因组分为三个ORFs：ORF1（10～5112nt）、ORF2（5093 ～ 6715 nt）和ORF3（6715 ～ 7494nt）,其中ORF1与ORF2之间重叠20 bp,ORF2和ORF3之间重叠1 bp.GX213病毒株全基因组序列分析显示,其与引起2014年至2015年亚洲部分地区暴发的新型人GⅡ.17型诺如病毒变异株CUHK-NS-613（GenBank ID：KU561248）同源性最高（同源性最高为99.5％）.ORF1和ORF3区核苷酸和氨基酸序列都与CUHK-NS-613同源性最高（分别为99.5％,99.4％;99.5％,99.2％）.ORF2区分析序列发现其与CUHK-NS-491毒株（GenBank ID：KP698928）同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4％和99.8％,仅P1.1区发现了一个氨基酸的突变aa245P→S.另外,RdRp核苷酸和VP1氨基酸序列进化树分析显示该病毒株与人GⅡ.17型诺如病毒CUHK-NS-613和CUHK-NS-491的进化关系最近,而与首次被发现的猴GⅡ.17型诺如病毒KM1509（GenBank ID：KX356908）次之.结论 本研究发现的GX213属于2014年至2015年在亚洲地区引起暴发的新型人GⅡ.17型诺如病毒变异株,提示GⅡ.17型诺如病毒为人猕猴共患病毒.

人呼吸道合胞病毒微型复制子的构建

【目的】构建RSV微型复制子(minireplicon)并进行功能学研究。【方法】构建含RSV病毒前导序列(Leader,genomic promoter,Le)、转录起始信号(gene start,GS)、多克隆酶切位点、转录终止信号(gene end,GE)和尾随序列(Trailer,antigenomic promoter,Tr)的基因片段GSGE,通过引入T7RNA多聚酶(T7RNApolymerase,T7RNP)启动子、克隆入载体px8δT和插入增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)等多步操作,获得RSV微型复制子重组质粒px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP。同时构建可表达大蛋白(large protein,L)的质粒pcDNA3.1/L及表达转录延长/转录终止抑制因子(M2ORF1protein,M2-1)的质粒pcDNA3.1/M2-1。通过脂质体法共转染RSV微型复制子质粒及四种RSV核壳体蛋白质粒至可表达T7RNP的BSRT7/5细胞系,倒置荧光显微镜及流式细胞仪分析EGFP的表达情况。【结果】成功构建了px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP及pcDNA3.1/L和pcDNA3.1/M2-1,五质粒共转染BSR T7/5细胞,倒置荧光显微镜及流式细胞仪均观察到绿色荧光的表达。【结论】构建的RSV微型复制子具有转录和复制功能,将有助于进一步开展以RSV反向遗传操作为基础的RSV疫苗研发及药物筛选。