嗜线虫致病杆菌高产菌株的选育

用 4种诱变方法 (紫外线、氯化锂、60 Co γ射线、自身代谢产物 )对嗜线虫致病杆菌进行了诱变处理。结果表明 ,菌株对各种诱变剂均比较敏感 ,低剂量诱变和复合诱变处理的菌株正变率较高 ,其中氯化锂加紫外线复合诱变的累加处理效果最好 ,效价提高了 6 0 %～ 70 % ;连续5代传代培养 ,其产素能力基本稳定。

一种促进植物根系生长的极细链格孢菌蛋白质分离、纯化和生物功能

通过硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀、离子交换和分子筛连用的方法,从极细链格孢菌JH505菌株中分离纯化到分子量约为35kD的植物激发子。利用固相梯度凝胶双向电泳方法测定了该蛋白的等电点为4.22。将该纯化蛋白稀释液浸泡小麦种子8h,7d后小麦根系琥珀酸脱氢酶活性提高65.27%,经蛋白处理的小麦根长比对照提高13.1%。

细极链格孢菌蛋白激发子诱导棉苗基因表达差减文库的构建及EST分析

利用细极链格孢菌蛋白激发子粗提蛋白液诱导棉花苗期相关基因表达，以清水喷施为对照样本，进行抑制差减杂交，构建棉花苗期基因表达文库。结果显示，插入片段的大小主要集中在200～1000bp。随机选取150个克隆进行菌液PCR检测与测序，并将所测序列与Gen-Bank dbEST库进行比对，共得到104个单一序列。其中，78个EST与其它物种已知基因部分区域的同源性为48．54％～100％，占总EST的75％；6条EST序列能在数据库中检索到同源性序列，但其功能尚不清楚，占5．77％；10个EST能在数据库中发现为推测蛋白，占9．6％；10个EST在GenBank中没有查到对应的同源序列，可能是新基因，占9．6％。同时，将所得到的104条EST序列在WEGO网站上进行功能分类，通过Gene ontology确定具体EST的分子功能。其中，在生物途径分类中，与生理途径和细胞过程相关的EST最多，分别为48个和45个；在细胞组份功能分类中，与细胞相关的EST最多，达到44个；在分子功能分类中，催化功能与分子绑定相关的EST数量最多，分别达到了30个和28个。由此可见，细极链格孢菌蛋白激发子诱导棉苗时涉及到植物的生理生化的多条途径，受到多个基因的调控，可能包括抗病与防御蛋白、信号传导蛋白、转录因子、能量代谢相关蛋白、抗逆相关蛋白、细胞保护机制蛋白、功能未知及其它蛋白等相关蛋白。

蛋白激发子基因pemG1转化三生烟及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的植物表达载体pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs转化三生烟(Nicotiana tobacum cv.SamsunNN),获得了转基因植株。用PCR检测抗卡那霉素烟苗确认阳性转化株,用Southern、Northern和Western杂交进一步证实了pemG1基因的整合、转录和表达。对T2代转基因阳性株进行烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)接种试验。接种5d后发现,与非转基因对照相比,表达pemG1的烟草叶片枯斑数量减少,表明稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。

致病杆菌D43菌株产素培养基及发酵条件

对致病杆菌产生抗生素的发酵培养基和发酵条件进行了研究，同时对该菌代谢过程pH值、还原糖、总糖、氨基氮与抗生素产量的关系进行了分析。通过筛选，确定了对该菌产素有利的碳源、氮源和无机盐。用正交试验初步确定了该菌产素的最佳发酵培养基和条件为（g／L）：麦芽糖5g，牛肉胨10g，牛肉膏5g，CaCl25g，KNO30．2g。发酵培养基的起始pH值在6．0～8．0、种龄16h、摇瓶装量25—150ml／500ml的条件下，培养72h可获得较高的抗生素产量。产素量与菌代谢过程中pH、还原糖、总糖和氨基氨的变化有一定关系。通过培养基和培养条件的研究使该菌的产抗生素能力提高了46．67％。

七种我国昆虫病原线虫共生菌的分离与鉴定

昆虫病原线虫共生菌是一类具有广阔发展前景的生物防治资源,由于这类菌的分类鉴定工作起步晚,存在分类混乱和不系统的现象,在本土资源十分丰富的我国尤为突出。本文对本实验室分离的7个共生菌菌株进行了分类描述,建立了以生理形态,生化特征为分类基础,结合16S rDNA序列分析的有效鉴定方法。

嗜线虫致病杆菌CB6菌株胞内外杀虫蛋白的纯化及比较研究

【目的】分离和纯化嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophila var.pekingensis)CB6菌株胞内和胞外杀虫蛋白,鉴定其蛋白种类。为进一步利用此类杀虫蛋白奠定基础。【方法】采用硫酸铵沉淀、DEAESepharoseFF离子交换柱层析、Butyl SepharoseFF疏水柱层析和SephacrylS-200HR凝胶过滤对该类蛋白进行分离和纯化,采用Native-PAGE和SDS-PAGE技术对所纯化蛋白进行组分分析。【结果】获得达电泳纯的胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2。以2.58μg·ml-1含量E1、以4.21μg·ml-1含量E2喂饲棉铃虫初孵幼虫,对幼虫的生长抑制率分别达62.63%和97.9%。E1、E2经相同纯化参数处理获得的洗脱图相似,经native-PAGE和SDS-PAGE呈现出相似的单带电泳图谱。SDS-PAGE测得E1、E2表观分子量大于212kD,该杀虫蛋白在60℃仍表现出较强的活性。电泳染色结果表明该类蛋白非糖蛋白也非酯蛋白。【结论】CB6菌株胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2可能是同一种(类)蛋白。

球孢白僵菌对德国小蠊侵染力的初步研究

在实验室控温控湿条件下，研究了１０株白僵菌菌株对德国小蠊的侵染能力。试验结果表明不同菌株侵染力存在差异，其中菌株１１５９＃和１１５０＃的侵染力最强，死亡率达５６．７％，其它８个菌株的死亡率为１０．０％～５０．０％。随菌液浓度提高虫体死亡率增加。

拟双角斯氏线虫D43品系鞘蛋白对大蜡螟幼虫的免疫抑制作用

侵染期的拟双角斯氏线虫Steinernema ceratophorumD43品系体外都包裹着一个透明的体鞘。为探明体鞘对线虫侵染力的影响,了解鞘蛋白(sheath proteins,SPs)对大蜡螟Galleria mellonella幼虫的免疫抑制作用,本研究通过化学方法使拟双角斯氏线虫D43脱鞘,以对寄主的致死率和侵入点数量为指标,与包鞘线虫比较对大蜡螟幼虫的侵染力;采用乙醇提取的方法获得线虫鞘蛋白,利用双向电泳和质谱技术对鞘蛋白进行鉴定分析;从血细胞数量和酚氧化酶活力两个方面评价鞘蛋白对大蜡螟幼虫免疫反应的抑制作用。结果表明:0.5%次氯酸钠处理20min可以保证95%以上的线虫存活和脱鞘。与包鞘线虫相比,脱鞘线虫对大蜡螟幼虫的致死率显著降低,致死时间延后,节间膜侵入点数量显著减少。以35%乙醇提取的鞘蛋白提取物可鉴定出6种鞘蛋白,其中一个被鉴定为丝氨酸蛋白酶。此外,血腔注射鞘蛋白提取物可导致试虫血细胞数量明显降低,酚氧化酶活力受到显著抑制。由此说明,体鞘对拟双角斯氏线虫D43的侵染力具有显著影响,鞘蛋白在抑制寄主昆虫免疫反应中发挥重要作用。

灰葡萄孢菌激活蛋白对番茄灰霉病的诱导抗性及防御相关酶活性的影响

为探索激活蛋白对植物诱导抗病性机理,分析诱导过程中植物的应激反应,采用室内盆栽的方法,研究了来源于灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的14 kD激活蛋白PEBC2诱导番茄对灰霉病的抗性,结果表明,经1.182μg/mL激活蛋白诱导处理后番茄对灰霉病的抗性有显著提高,番茄接种灰霉菌17 d后,对灰霉病的诱抗效果达到67.03%。测定了番茄体内与抗病代谢有关的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的动态变化,经激活蛋白处理后,番茄幼苗叶片的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性均有不同程度提高,PAL活性在诱导48 h后达到最高,比对照提高53.82%;POD活性在诱导168 h后达到最高,是对照的2.63倍;PPO活性在24 h和120 h出现2个峰值,分别比对照增加77.57%和87.21%。说明防御相关酶活性的提高,是激活蛋白诱导番茄植株抗灰霉病的主要生理机制之一。

昆虫病原线虫共生菌胞内外蛋白的提取及杀虫活性比较

通过超声波破碎、硫酸铵盐析等方法从10株昆虫病原线虫共生菌的发酵液中分离出各菌株的胞内和胞外蛋白,测定各蛋白样品含量及其对棉铃虫初孵幼虫的生长抑制毒性,并用Native-PAGE和SDS-PAGE对各粗蛋白组分进行初步分析。结果表明有7个菌株的胞内和胞外蛋白对棉铃虫初孵幼虫生长均显示出不同程度的抑制生长活性。其中以嗜线虫致病杆菌3个菌株CB6、All和Bw活性最强,其胞内蛋白的活性分别达97.1%、97.9%、97.2%,胞外蛋白分别达95.8%9、6.3%、88.6%。不同菌株胞内胞外蛋白产量各不相同。电泳图谱表明,不同菌株间及同一菌株胞内胞外蛋白有差异,但近缘菌株相似。

嗜线虫致病杆菌的抑菌物质及抑菌活性

嗜线虫致病杆菌北京变种（Xenorhabdus nematophila var．pekingense）是从北京地区采集的小卷蛾斯氏线虫（Steinernema carpocapsae）肠道内分离的共生细菌，具有自主知识产权，分离纯化出其发酵代谢物中的抗菌物质，进行抗菌活性测定，对研究该菌的抑菌机理以及开发利用具有重要意义。本文从该菌株代谢物中分离获得的抗菌物质经紫外光谱、红外光谱、核磁共振、高分辨质谱以及理化性质分析，鉴定为Xenocoumacin 1。用平板含毒培养基法测定了该物质对12种植物病原真菌的抑菌活性。研究表明，分离的活性物质具有较强的抑制活性，浓度在10μg／mL时，对黄瓜疫霉病菌、苎麻疫霉病菌、辣椒疫霉病菌，西葫芦灰霉病菌，苹果斑点落叶病菌的菌丝抑制率为100％。对草莓疫病病菌、苹果腐烂病菌、苹果褐斑病菌、着茄灰霉病菌、苹果轮纹病菌抑制率分别为86.8％、79．4％、79．5％、62．6％、53．6％；对其中6种真菌的EC50为0．25-4．17 μg／mL，该物质对疫霉属真菌抑制作用最强，并能引起番茄晚疫病菌的菌丝生长畸形，原生质外溢。本文对开发新型生物杀菌剂的研究奠定了基础。

不同培养基上繁殖的昆虫病原线虫格氏线虫表皮蛋白的差异

表皮蛋白(surface coat proteins,SCPs)是格氏线虫Steinernema glaseri克服寄主免疫系统的关键因素,能够抑制昆虫免疫反应,促进线虫的侵染。为了进一步研究表皮蛋白抑制昆虫免疫的作用机理和线虫与寄主间的相互关系,我们比较分析了不同培养基繁殖的格氏线虫表皮蛋白的差异。我们用人工培养基和大蜡螟Galleria mellonella末龄(5龄)幼虫分别培养得到格氏线虫侵染期幼虫,利用酒精提取表皮蛋白。SDS-PAGE和非变性PAGE分析显示,大蜡螟来源的格氏线虫的表皮蛋白具有更多的蛋白条带。体外和体内的裂解血细胞实验表明,大蜡螟来源的格氏线虫的表皮蛋白表现出强烈的裂解血细胞活性,而人工培养基来源的格氏线虫的表皮蛋白活力不明显;且具有裂解血细胞活性的表皮蛋白为诱导表达型蛋白。不同培养基来源的格氏线虫的表皮蛋白组成的差异和活性的不同,表明格氏线虫表皮蛋白的产生受线虫培养条件影响较大。

高毒力杀虫细菌嗜线虫致病杆菌CB6菌株的培养基优化

用正交试验法研究了嗜线虫致病杆菌北京变种菌株CB6的营养利用以及培养基成分的改变对产生杀虫活性物质的影响。通过筛选该菌对碳源、氮源以及无机盐的需求,确定了该菌的最佳发酵培养基为(g/L):豆粉40g,蔗糖15g,蛋白胨15g,酵母膏10g,玉米浆5g,NaH2PO41g,NaCl5g,谷氨酸5g。培养液上清液对玉米螟初孵幼虫的体重抑制率为90 81%,比基础培养基的杀虫活性提高了46.5%。

拟双角斯氏线虫共生细菌的分离与鉴定

从我国东北地区采集的拟双角斯氏线虫(Steinernema ceratophorum)肠道内分离到1株具有较强生物活性功能的致病杆菌菌株CB43。形态特征及生理生化特征测定结果表明,CB43菌株与致病杆菌属(Xe-norhabdus)的基本特性相似;对寄主线虫的产量有明显的促进作用,其代谢物对细菌和真菌均有较强的抑制活性,符合线虫共生菌的基本特性和功能。16S rRNA序列及根据16S rRNA序列构建的系统发育树中,CB43菌株与Xenorhabdus budapestensis序列同源性最高,形成一个类群。但CB43菌株不能产生吲哚,在麦芽糖、海藻糖、D-葡萄糖酸和乙酸利用等生化特征与X.budapestensis存在一定的差异,可能是由于菌株的生态差异造成的。根据形态及生理生化特征,结合16S rRNA序列分析,CB43菌株属于Xenorhabdus budapestensis。

致病杆菌CB43菌株对灰霉病菌的抑制作用

测定了致病杆菌CB43菌株代谢物对灰葡萄病菌菌丝生长和孢子萌发的影响。结果表明:CB43代谢物对灰葡萄孢菌丝生长有较强的抑制作用,500、250、125ml/L代谢物能完全抑制菌丝的生长,并具有杀死作用。62.5ml/L的发酵液处理灰葡萄病菌菌丝72h的抑制率仍达83.35%。20ml/L的发酵液处理灰葡萄孢菌丝能引起菌丝畸形,异常分支、粗短。CB43代谢物能杀死灰葡萄孢分生孢子或抑制其萌发,500~62.5ml/L的发酵液处理16h后,孢子萌发抑制率达88.1%~97.91%。温室试验表明,CB43代谢物对黄瓜灰霉病的控制效果达84.09%,化学农药40%施佳乐的效果为72.94%。

杨怀文先生在昆虫病原线虫研究与利用中的贡献——追忆杨怀文先生

本文回顾了20世纪80年代以来杨怀文先生在中国昆虫病原线虫研究中的主要工作,包括昆虫病原线虫固相离体培养技术的改进,线虫毒力测定标准化技术、大量贮存技术以及应用线虫防治害虫技术等研究,为昆虫病原线虫在我国的研究与利用做出了重要贡献。

电子商务的发展对实体店的影响及应对

20世纪90年代以来,在IT技术的发展和国家政策的带动下,我国的电子商务以前所未有的速度和规模不断的向前推进。不仅规模、范围、影响巨大,而且各种新平台（如网络、手机、移动、支付、物流）,新模式（如微销、网络营销、团购、秒杀）,新特征（如娱乐与营销相结合、互动与销售结合、图片表达和价格比较相结合）等,接连不断出现,呈现出一片繁荣的景象。

稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

设计含MluⅠ酶切位点的接头,将其连接入经KpnⅠ和BamHⅠ酶切后的质粒pCAMBIA2300-U-bi-Ocs,得到pCAMBIA2300-Ubi-adaptor-Ocs。设计含有KpnⅠ和MluⅠ酶切位点的引物,以稻瘟菌基因组DNA为模板扩增得到pemG1序列。将其连接入pMD18-T得到pMD18-T-pemG1。最后,用KpnⅠ和MluⅠ从pMD18-T-pemG1切下pemG1基因片段,将其连接入pCAMBIA2300-Ubi-adaptor-Ocs的KpnⅠ-MluⅠ酶切位点,构建成稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的植物表达载体体pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs。用冻融法将pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs导入根癌农杆菌菌株AGL-1,再通过根癌农杆菌介导转化获得了转基因烟草株系。用PCR,Northern和Western杂交验证了pemG1基因在受体烟草基因组中的整合,转录和表达。此研究为下一步通过稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达来提高转基因烟草的抗病性打下了基础。