鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

基于数据挖掘探讨中药防治黄曲霉菌感染的用药规律

本研究基于网络药理学等数据挖掘方法探究中药干预黄曲霉菌感染的用药规律。通过GeneCards数据库获得并筛选黄曲霉菌感染潜在靶点,同时在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)筛选口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18的候选化合物及中药,随后构建关键靶点-候选化合物-候选中药网络,并通过检索各候选中药的性、味、归经等相关信息,分析出相关用药规律。结果表明:利用数据库共筛选出69个黄曲霉菌感染相关靶点,收集到54个候选化合物,筛选到275味中药。用药频次统计结果显示,防治黄曲霉菌感染的候选中药中,苦味、寒性居多,主要归肝、肺二经。本文系统地分析了中药干预黄曲霉菌感染的小分子物质基础,归纳了一般用药规律,可为临床治疗黄曲霉菌感染等相关疾病的新药研发及中药治疗提供一定的参考及思路。

Ⅰ亚群禽腺病毒现状及其研究进展

Ⅰ亚群禽腺病毒近年来多地都有过相关报导,其传播速度以及传播范围呈上升趋势,给全球的养禽业造成了巨大损失。本文对禽腺病毒分类、检测方法以及疫苗研究等进行综述,旨在为该病的防控提供参考。

关于SPF鸭产业发展的思考与建议

无特定病原(Specificpathogenfree,SPF)鸭和鸭胚是为农业研究而计划生产的原材料,对鸭生产、生命科学和生物制品研发具有重要意义。本文综述了我国SPF鸭目前的发展现状及存在的若干问题,并简要提出了相应的建议。

基于网络药理学与分子对接技术探究辣木叶治疗肠炎的作用机制

本研究旨在采取网络药理学与分子对接技术探究辣木叶水溶性活性成分治疗肠炎的作用机制。通过文献检索搜集辣木叶水溶性活性成分,在PubChem数据库获取化学结构,通过Swiss Target Prediction数据库预测潜在靶点,同时检索GeneCards数据库获取辣木叶活性成分与肠炎重合靶点;随后将上述重合靶点导入STRING数据库构建蛋白质互作(PPI)网络,通过Cytoscape软件CytoNCA插件筛选核心靶点,随后经DAVID数据库对筛选的核心靶点进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析,并运用R语言clusterProfiler程序包分析关键通路富集靶点情况,最后经Autodock-Tools软件将核心靶点以及活性成分进行分子对接。结果表明:1)筛选出的辣木叶水溶性活性成分主要包括芥子酸、肉桂酸、山奈酚、槲皮素、柚皮素、辣木碱、niazimin A和原儿茶酸等31种,其对应的核心靶点有35个。2)PPI网络分析结果发现,SRC原癌基因非受体酪氨酸激酶(SRC)、表皮生长因子受体(EGFR)、基质金属蛋白酶9(MMP9)以及蛋白激酶B1(AKT1)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)和热休克蛋白90α家族A类成员1(HSP90AA1)等是辣木叶治疗肠炎的关键靶点。3)KEGG信号通路富集分析发现,筛选的核心靶点主要参与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)、Toll样受体(TLR)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NOD样受体等信号通路,并通过EGFR、MMP9、RELA原癌基因核因子-κB亚基(RELA)、SRC、AKT1、核因子-κB亚基1(NFKB1)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、Toll样受体4(TLR4)、HSP90AA1、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和CREB结合蛋白(CREBBP)等起到治疗肠炎的作用。4)分子对接预测结果表明,芥子酸和niazimin A与关键靶点均能稳定结合。综上可知,辣木叶活性成分可通过相应的信号通路发挥抗炎、抗病毒作用,同时也可调节细胞分化、凋亡等生物过程,这为辣木叶在肠道性疾病中的进一步发展和应用提供了理论基础。

2015～2016年山东、河北地区鸭疫里默氏杆菌流行病学调查

2015~2016年间从山东及河北等地的商品鸭场病料中共分离出18株鸭疫里默氏杆菌。分离菌株革兰氏染色为阴性小杆菌,无芽孢,大小0.2~0.4×1~5μm;分离菌不能利用碳水化合物,过氧化氢酶试验为阳性;经凝集试验鉴定所分离到的细菌均为血清1型鸭疫里默氏杆菌;易感鸭的动物回归试验能够复制出典型的原始病例。以上研究为鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗的研制提供重要的研究基础。

2016年～2017年山东地区商品肉鸡H9N2亚型禽流感病毒HA基因的分子特征和遗传进化分析

为了解山东地区商品肉鸡H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株的遗传变异情况,本研究对13株从不同肉鸡场分离的H9N2 AIV的HA基因进行PCR扩增、克隆和测序,并对获得的HA基因序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示:13个分离株的HA裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;8株分离株有8处糖基化位点,其余5株存在个别位点缺失情况;受体结合位点除198位有变异外,其它位点均保守;234位氨基酸均为L,因此具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征。所有分离株HA基因核苷酸同源性为94.1%~99.8%,氨基酸同源性为94.3%~100%。HA基因进化树显示,所有分离株均属于欧亚分支中的A/Chicken/Beijing/1/1994(A/Duck/Hong Kong/Y280/97)亚群,也同属于近几年在中国鸡群中流行的以A/chicken/Zhejiang/HJ/2007为代表的G57分支。以上研究为H9N2亚型AIV的防控和疫苗研制提供了科学参考。

一株水貂犬瘟热病毒的分离与鉴定

为寻找免疫失败的原因,有效防治犬瘟热的流行,对临床一水貂犬瘟热疑似病例,取其肝、脾、脑等组织研磨后接种Vero和BHK细胞分离病毒,并对分离毒株进行一系列鉴定。通过电镜观察,发现了大小约150 nm的副黏病毒样粒子。结果表明,分离株对鹅、鸡、小鼠、家兔、山羊、猪红细胞均无凝集性,该分离株的毒价TCID50为10-4.87;分离株病毒对乙醚、氯仿敏感,病毒的核酸型为RNA。经间接免疫荧光试验,接种病毒的BHK细胞出现特异性的亮绿色荧光。对分离株和对照毒株分别提取RNA进行RT-PCR扩增,最后得到与预期扩增片段(294 bp)相符的核酸电泳带,充分证明分离病毒为犬瘟热病毒。

鸭大肠杆菌血清型分析和疫苗菌株的筛选

目的分析鸭大肠杆菌的血清型分布,并进行疫苗菌株的筛选。方法近年来从山东、河北等地区的商品鸭场送检的病料中分离大肠杆菌,并进行血清型鉴定和生物特性分析;通过毒力检测和免疫原性试验筛选疫苗菌株。结果共分离到44株鸭大肠杆菌。根据菌体抗原O进行分型,共鉴定血清型有6种:O78、O93、O76、O2、O92和O32;其中O78为优势血清型,占56.8%(25/44);O93血清型次之,占15.9%(7/44)。免疫原性试验证实O78血清型菌株SD具有较强的毒力和良好的免疫原性。结论分析地区的鸭场鸭大肠杆菌以O78、O93、O76为优势血清型;免疫原性较好的SD菌株可作为下一步研制灭活疫苗的候选菌株。

水貂和狐犬瘟热病毒F基因的克隆与序列分析

为探寻免疫失败的原因,对山东某养殖场免疫后的发病水貂和狐犬瘟热组织病料分别提取RNA进行RT-PCR扩增。将PCR得到的部分F基因克隆到pMD18-T载体上测序,并与疫苗株ND进行序列分析。结果表明,水貂和狐的CDV与OND的核苷酸同源性为98.6%9、8.6%,氨基酸同源性为98.0%9、8.0%。水貂和狐两者核苷酸同源性为98.0%,氨基酸同源性为95.9%。

肉鸽新城疫病毒山东分离株的分离鉴定及其F基因的分子特性分析

从山东某发病肉鸽的体内分离到一株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV),命名为Pigeon-Shandong-JN-08(简写JN08),对其融合蛋白(fusion,F)进行序列和分子特性的分析,以了解肉鸽NDV的遗传起源和分子特性。JN08经病毒蚀斑克隆纯化后动物回归试验可产生典型的NDV病变。研究结果发现,F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合鸽源NDV强毒氨基酸基序。F基因分型及同源性比较显示:JN08与绝大多数鸽源毒株同属于基因Ⅵ型;其F基因与基因Ⅱ型毒株LaSota,B1,Bingham,TEX-48氨基酸同源性为89.9%,89.7%,90.4%,89.7%,与基因Ⅰ型毒株Ulster67的氨基酸同源性为91.3%,与基因Ⅲ型传统强毒F48E9的氨基酸同源性为92.8%;与国内鸽分离株P1-03,CH98-98,JS1-06,PB01-96和GZ-07的氨基酸同源性分别为91.3%,94.6%,94.8%,95.1%,94.0%;与国外鸽分离株Capital3-97,Tigre6-99,1166-02,IT227-97,2736-00,NY-84,TX3503-04,248VB-98的同源性分别为96.2%,93.8%,98.0%,96.8%,97.1%,96.8%,96.8%,98.4%。从F基因遗传进化树上发现:JN08与国外分离株的遗传距离较近,处于同一基因亚型上,而与国内分离株的遗传距离较远。

新城疫病毒的抗肿瘤作用及其研究进展

19世纪50年代，新城疫病毒使人的晚期胃癌的转移受到抑制的情况引起人们的关注。随后的研究发现NDV在肿瘤细胞中的复制是在正常细胞中复制的10000倍；而且仅特异性地杀伤肿瘤细胞，对正常的细胞没有毒副作用。而目前国内外针对癌症肿瘤的治疗还多数依赖于放疗、化疗等手段，这些治疗方法副作用大、

野禽新城疫病毒F和HN基因的遗传变异趋势

野禽携带的新城疫病毒是新城疫流行传播的重要的潜在传染源。结合本实验室克隆测序的鸽NDV(PB9601)、企鹅NDV(QE01)以及GenBank下载的44株野禽(包括野鸭、鹦鹉、鸽子、天鹅、鸳鸯、雁、火鸡等)的NDV毒株的融合蛋白(Fusion gene,F)基因和血凝素蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase gene,HN)基因分别进行了F蛋白裂解位点、基因分型以及F和HN基因氨基酸全长的遗传距离分析。结果表明:野禽感染NDV F基因的基因型以Ⅶ和Ⅵ为主,同时Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ和Ⅸ多种基因型并存。同一种属、同一地区的毒株间的遗传距离较近,具有明显的种属性和区域性,且绝大多数分离株与经典毒株LaSota、V4、B1、TEX-48等的遗传距离相对较远;对HN基因的遗传进化关系分析得出了相似的结论。

犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒F基因序列设计了1对引物,以从水貂犬瘟热病毒中提取的RNA为模板,扩增出一约1 000 bp的F基因片段。将PCR产物按相应的阅读框架克隆到原核表达载体pET-32a中,并将重组质粒转化E.coliBL21(DE3),用1.0 mmol/L IPTG在30℃下诱导表达。结果显示,F基因的表达量约占细菌总蛋白的35%。SDS-PAGE电泳显示,表达产物的分子质量约为55 ku,与预计大小相符;经Western-blotting试验进一步证实,该基因获得了正确表达。

NDV和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位点的差异分析比较

本文就禽副黏病毒的两种不同血清型APMV-1(以NDV为代表)和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位点进行分析比较。分析显示:F蛋白糖基化位点NDV强弱毒株毒株均有6处糖基化位点,而APMV-4毒株则只有4处潜在的糖基化位点,而且位置与APMV-1略有不同。同时,NDV强毒株GM的HN蛋白有5个潜在的糖基化位点,而La Sota弱毒株有6个潜在的糖基化位点,即538~540位为NKT;APMV-4毒株有7处潜在的糖基化位点,且位置与APMV-1完全不一致。

新城疫病毒SGM01分离株F基因多肽重复区的序列分析和初步表达

从新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)SGM01强毒分离株的F基因克隆出两段七肽重复序列(Heptad Repeat Region,HR)HR1和HR2,通过氨基酸序列分析显示:SGM01分离株的HR1区与F48E9、La-Sota的同源性分别为95.2%、93.7%;HR2区与F48E9、LaSota的同源性分别为89.1%、85.5%。将HR1和HR2分别插入融合表达载体pGEX-6p-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,得到预期大小的目的蛋白。这为研究HR1和HR2的结构以及其在F蛋白融合过程中所起的作用奠定了基础。

鸡传染性支气管炎病毒山东株的遗传变异分析

采用RT-PCR方法对1株传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）Chicken-SD-E-04的S1和N基因进行扩增、克隆测序。通过序列分析发现：该分离株的N基因相对较为保守,与参考毒株的氨基酸同源性在87.1%-91.2%;从N基因的遗传关系树上分析显示Chicken-SD-E-04与其他多数分离株间及疫苗株的遗传距离较远。而就S1基因而言,分离株与参考毒株的氨基酸同源性在73.2%-80.1%;从S1基因的遗传关系树上分析发现Chicken-SD-E-04与疫苗株的遗传距离较远,且处于不同的分支上。其结果说明这株山东分离株具有明显的地域性;而且也从分子水平上证实了目前山东流行毒株与传统疫苗株的遗传距离较远。

鸡新城疫病毒的抗肿瘤作用

19世纪50年代。新城疫病毒使农场主晚期胃癌的转移受到抑制的情况引起人们的关注。在随后的研究中发现新城疫病毒在肿瘤细胞中的复制是在正常细胞中复制的1万倍：而且仅特异性地杀伤肿瘤细胞．对正常的细胞没有毒副作用。而目前国内外针对癌症肿瘤的治疗还多数依赖于放疗、化疗等手段，这些治疗方法副作用大、对正常的组织器官有所损伤、容易复发、花费高等缺点．故针对新城疫病毒抗肿瘤作用的研究成为目前肿瘤治疗研究的新热点之一。本文就新城痤病毒抗肿瘤的作用基础、抗肿瘤作用的机制以及国内外的相关研究概况进行综述。

2012～2016年山东省新城疫病毒的毒力分布、遗传进化、糖基化位点的分析

对2012~2016年来自山东省8个地区的新城疫病毒(Newcastle Disease virus,NDV)分离株进行毒力分布、遗传进化、糖基化位点分析,结果发现近年来山东省NDV分离的阳性率整体呈下降趋势,中等以上毒力毒株所占比例亦逐年下降。病毒流行的基因型以基因Ⅶ型、基因Ⅱ型、基因Ⅵ型为主,F基因的糖基化位点等未发生较大变化。研究结果为新城疫的综合防控奠定了科学基础。

新城疫病毒SD强毒株全长cDNA克隆的构建及序列分析

将新城疫病毒SD强毒株的全基因组cDNA序列进行分段扩增,并将各个片段通过In-Fusion技术连于克隆载体pBR322上,获得了SD毒株的全基因组cDNA克隆。通过分段PCR扩增鉴定及全长测序分析,结果表明,SD毒株的全基因组cDNA克隆构建成功,并且成功引入T7启动子序列,全长基因组序列与亲本毒氨基酸序列的一致性为99.9%。单个序列比对发现,全基因组cDNA克隆中有11处碱基突变,其中只有2处引起氨基酸序列发生改变;整个序列未出现基因的缺失、插入变化,因此全长氨基酸的位数未发生任何变化。SD毒株全长cDNA克隆的成功构建和序列分析为后续的反向遗传操作奠定了关键的技术基础。