犬细小病毒VHH抗体的文库构建、表达及其鉴定

为构建特异性犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)的纳米抗体库,并获得特异性抗CPV的重链单域抗体(Single variable domain on a heavy chain antibodies,VHH抗体),以分离鉴定的一株CPV-2c毒株(TS02株)作为免疫原免疫羊驼,四免后采集外周血,分离淋巴细胞,利用巢式PCR扩增VHH序列,通过噬菌体展示技术成功构建了纳米抗体的CPV免疫文库,进一步通过ELISA特异性筛选具有高亲和力的抗CPV纳米抗体序列。将筛选出的抗体序列插入pcDNA3.1真核表达载体构建pcDNA3.1-VHH重组质粒,采用PEI转染高密度的HEK293F悬浮细胞,瞬时表达、纯化VHH,进行鉴定。结果表明,四次免疫后羊驼血清效价高达1∶25000,达到了建库要求,构建的纳米抗体的CPV免疫文库,库容达2×10^(6)CFU/mL,文库多样性良好。通过特异性筛选获得了4株具有高亲和力和特异性的抗CPV纳米抗体序列,采用HEK293F细胞瞬时表达并纯化获得4个重组VHH,分别是CPV-VHH-H1、CPV-VHH-D4、CPV-VHH-F5和CPV-VHH-E3。ELISA和IFA试验结果表明,表达出的4株重组纳米抗体均能够特异性结合CPV。本研究成功构建了CPV特异性纳米抗体文库,并筛选出4株特异性结合CPV的VHH抗体,为VHH抗体在犬细小的诊断和治疗方面的应用进行了初步探索。

应用酵母双杂交系统初步筛选IBDV VP2结合蛋白

用RT-PCR扩增VP2 cDNA并克隆入诱饵载体pSos,与鸡法氏囊cDNA文库中分离的质粒DNA共转化cdc25H,筛选阳性酵母克隆;用酵母质粒DNA转化大肠杆菌,提取质粒再分别与诱饵载体pSosVP2共转化酵母细胞,利用酵母双杂交系统对阳性克隆进行验证。对阳性克隆的插入片段进行序列分析,根据生物信息学分析结果初步确定IBDV VP2结合蛋白编码基因。结果显示,经酵母双杂交共筛选出48个候选阳性克隆,分别转化酵母菌,经酵母双杂交验证后,获得阳性克隆19个。进一步的序列分析显示,在19个插入序列中,共编码8种不同的多肽,分别是Ras超家族中的RRAS2、Rit1和N-Ras,肿瘤相关蛋白TCTP和PARP14,抗病毒Mx蛋白,LAMB3蛋白以及蛋白激酶PRKX。VP2候选结合蛋白的获得为IBDV受体、诱导细胞凋亡或逃逸宿主抗病毒机制等研究奠定了基础。

利用SMART技术构建鸡法氏囊全长cDNA表达文库

为构建鸡法氏囊组织互补DNA(cDNA)文库,从3周龄鸡法氏囊组织提取总RNA,用偶联oligo(dT)磁珠纯化mRNA,用SMART(Switching methanism at 5′end of RNA transcrip)技术合成cDNA第1链,用LD-PCR方法扩增双链cDNA。经SfiⅠ酶切消化后,用CHROMA SPIN-400柱去除400 bp以下小片段,获得的双链cDNA与同样酶切的pMyr表达载体连接,电转化大肠杆菌获得cDNA文库。初始文库容量为2.8×10~6cfu,重组子比例为100%,插入片段的大小平均为1.2 kb。扩增后文库容量为8×10^(11)cfu·mL^(-1)。所建文库为鸡传染性法氏囊病毒受体基因克隆及功能研究奠定基础。

三株鸡传染性法氏囊病毒弱毒株的分离与分子鉴定

本试验在江苏省鸡场分离获得3株鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV),采用RT-PCR法扩增VP2基因,将产物克隆入pMD18T载体,经测序,并与IBDV代表株VP2基因的高变区序列进行分析比较。结果显示,3个分离株与超强毒株、强毒株、突变株及弱毒株的核苷酸同源性在89.5(～98.9(之间,与弱毒株Cu-1和疫苗株PBG-98同源性最高,为98.9(;推导出的氨基酸序列与代表性毒株的同源性在98.2(～99.5(之间。其中,七肽区的第三个丝氨酸残基突变为精氨酸或苏氨酸,279和284位氨基酸残基突变为天冬氨酸和苏氨酸,222、294和299位氨基酸残基分别突变为脯氨酸、亮氨酸和天冬氨酸。上述试验表明3株分离株均为临床弱毒株。

犬瘟热病毒截短P蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)P1蛋白的单克隆抗体(McAb),本研究利用重组犬瘟热病毒P1蛋白免疫BALB/c小鼠,并将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,用CDV包被ELISA板,通过间接ELISA法筛选出两株稳定分泌抗CDV-P1的杂交瘤细胞株(E9E4C10、E9F8D9)。间接ELISA检测腹水效价均为1∶106,亚类鉴定结果均为IgG2b。Western blotting和间接免疫荧光(IFA)分析结果表明,两株单克隆抗体均能与重组P1蛋白和CDV发生反应;ELISA叠加试验增殖结果表明,两株单克隆抗体识别的抗原表位不同。本研究制备的特异性抗CDV-P1的单克隆抗体为建立CDV免疫学检测方法和P蛋白的功能研究奠定了基础。

细粒棘球绦虫抗原B的研究进展

细粒棘球绦虫抗原B(AgB)是血清学诊断棘球蚴病最重要的抗原,也是目前研究最多的抗原之一。深入研究抗原B对棘球蚴病的血清学诊断、流行病学研究、综合防控和疫苗的研究开发具有重要的意义。文章针对近年来关于抗原B的分子生物学特征、免疫学特性及在人和动物等中间宿主的血清学诊断方面的研究进展进行综述。

犬细小病毒病流行病学调查

犬细小病毒感染是由犬细小病毒引起的一种急性、热性、传染性疾病,临床上以出血性肠炎或心肌炎为主要特征。本研究对泰州某宠物门诊2010年1月-2011年3月期间接诊的260例犬细小病例进行了分析研究,旨在了解泰州地区犬细小病毒病发病率、死亡率与犬年龄、品种、免疫接种、季节等因素之间的关系,并总结防控犬细小病毒病最有效的方法。结果表明,犬细小病毒病发病率及死亡率与犬的年龄、品种、免疫接种、季节有很大的相关性,依此提出了防制对策,以期为防制犬细小病毒病提供参考。

动物用质粒DNA内毒素去除方法的建立及其质量检验

用自行改进设计的TritonX-114方法去除动物用重组质粒DNA中的内毒素,鲎试剂检测方法确定每毫克质粒DNA中内毒素的含量为50 EU。将3种不同方法制备的重组质粒pEGFPN1包裹后转染COS-7、MDCK和Marc145细胞,结果表明,经TritonX-114去除内毒素后的质粒DNA(A)与无热源质粒提取试剂盒制备的质粒DNA(B)的转染效率相当,比未经内毒素去除的质粒DNA(C)的转染效率高。将上述3种方法制备的pcDNAlacZ经PEI包裹后尾静脉注射小鼠,注射后每隔2 d扑杀小鼠,取其心、肝、脾、肺和肾组织,定量检测β-半乳糖苷酶的表达和持续时间,结果显示报告基因仅在小鼠的心、脾和肝组织中表达至第8天,A与B的表达水平接近,且明显高于C制备的pcDNALacZ的表达水平,提示经TritonX-114去除内毒素后的质粒DNA可提高转染效率和表达水平。多种动物体内注射重组质粒后,无体温升高等异常临床表征,进一步说明了使用经TritonX-114去除内毒素的质粒DNA具备良好的安全性。

一株猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其VP2和NS1基因的变异分析

为分析当前猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)基因组遗传变异情况,对FPLV胶体金试纸条检测结果为阳性的猫粪进行病毒分离,通过血凝、分子生物学等试验对分离株进行鉴定。结果表明:病毒在CRFK细胞上盲传5代后产生明显细胞病变,电镜观察病毒粒子直径约25 nm,分离病毒的血凝效价为1∶256,将分离株命名为FPLV BJ04。基因组扩增结果显示,FPLV BJ04基因组大小为5 118 bp。决定病毒宿主范围和抗原性的VP2蛋白系统进化树分析表明,FPLV BJ04株与2017年意大利分离株KX434462株位于同一分支;分离株的VP2、NS1基因与GenBank收录的FPLV VP2、NS1基因相似性分别为99.1%～99.5%和99.0%～99.5%。动物回归试验中攻毒组猫出现临床症状和病理变化。本研究对分离的FPLV北京流行株的VP2和NS1基因进行遗传变异分析,可为更好地预防和控制FPLV提供基础。

鸭坦布苏病毒可视化RT-LAMP快速检测方法的建立与初步应用

为实现鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)的快速检测,本研究根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物,通过优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。结果显示,在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;该方法灵敏度是常规RT-PCR的100倍;只能特异性扩增坦布苏病毒,对于其他常见的禽源病毒无特异性扩增;检测结果可直接通过肉眼观察来判断;对临床74份疑似病料,可检出65份。本试验建立的方法灵敏性高、特异性强,可用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断和流行病学调查。

表达绿色荧光蛋白报告基因重组禽腺联病毒载体系统的构建与鉴定

为了开展重组禽腺联病毒(Recombinant avian adeno-associated virus,rAAAV)介导的基因转移研究,用限制性内切酶消化含AAAV全基因组的重组质粒pCR-AAAV,去除AAAV Rep和Cap蛋白编码序列,将PCR扩增的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)报告基因插入AAAV末端反向重复序列(Inverted terminal re-peats,ITR)之间,获得表达GFP基因的AAAV转移载体pAITR-GFP;以含AAAV全基因组的质粒为模板,用PCR分别扩增AAAV Rep、Cap和Rep-Cap蛋白基因,将Rep和Cap基因分别插入真核细胞双表达载体pVITRO2-mcs的两个多克隆位点,将Rep-Cap蛋白基因插入真核细胞表达载体pcDNA3,获得AAAV辅助质粒pVITRO2-ARC和pcDNA-ARC;将pAITR-GFP、pVITRO2-ARC或pcDNA-ARC与腺病毒辅助质粒pHelper组成三质粒转染系统,用磷酸钙沉淀法共转染AAV-293细胞,获得了表达GFP的rAAAV。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,纯化病毒出现分子量正确的VP1、VP2、VP3结构蛋白;经PCR检测证明,重组病毒中含有GFP报告基因;用重组病毒分别感染鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肝CEL细胞,可以观察到GFP报告基因的表达,表达时间持续两周以上。这些试验结果表明,成功建立了辅助病毒非依赖性rAAAV体外包装体系,为禽源细胞的基因转移研究和禽重组活载体疫苗的研制打下了基础。

复方中草药添加剂对林下生态鸡生长性能和免疫功能的影响

本试验旨在研究复方中草药添加剂对林下生态鸡生长性能和免疫功能的影响。将200只28日龄的林下生态鸡随机分为4组,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别按日粮的0.5%、1%、2%添加复方中草药制剂,空白组不添加任何药物,测定各组的生长性能、新城疫HI抗体水平、免疫器官指数及淋巴细胞转化率。结果表明,按1%、2%添加复方中草药能显著提高林下生态鸡的生长性能和成活率,显著提高HI抗体水平,延长持续时间,促进免疫器官的生长发育,显著提高淋巴细胞转化率。

禽源致病性沙门氏菌耐药表型与耐药基因的分析

为了解江苏苏中地区禽源沙门氏菌耐药现象及耐药基因的存在情况，采用K—B法对22株沙门氏菌分离株进行12种抗菌药物敏感性试验，并通过PCR方法检测了12种耐药基因的存在情况。结果显示，所有菌株对甲氧胺嘧啶、阿米卡星、庆大霉素、萘啶酮酸、诺氟沙星的耐药率均在72．73％～100％之间；存在着5种耐药表型，每个耐药表型均在4重或4重以上，耐药最多菌株可耐受10种药物；扩增出9种耐药基因，与GenBank中的参考序列同源性均在98％以上；耐药表型与耐药基因的存在基本一致，但无绝对相关性。本研究结果表明苏中地区沙门氏菌耐药现象非常严重，且耐药基因广泛存在。

蜡样芽孢杆菌芽孢萌发及其对常规灭菌方法抵抗力的研究

芽孢杆菌属细菌在芽孢状态下,对外界环境及理化因素具有高度抵抗力。适宜的温度、湿度及营养条件能促进芽孢萌发,影响其对常规灭菌方法的抵抗力。本试验选取蜡样芽孢杆菌作为研究对象,在适宜培养条件下使其形成芽孢,通过研究萌发后芽孢对温度、H2O2及含氯消毒剂等条件的抵抗力,证实了适当的条件(温度37℃、湿度40%、pH 7.4、30min)能有效促进蜡样芽孢杆菌芽孢萌发,致使芽孢对高温(80℃、2h)、H2O2(1.5mol/L、2h)及含氯消毒剂(有效氯含量约800mg/L、2h)等常规灭菌方法抵抗力明显降低,并能被有效杀灭和灭活,相对有效杀灭率分别达98.4%、98.9%及99.1%,有效杀灭率分别为88.3%、88.7%及88.9%,这对进一步研究芽孢杆菌属细菌的杀菌消毒条件具有重要参考意义。

犬瘟热病毒截短P蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备针对犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）P1蛋白的单克隆抗体（McAb），本研究利用重组犬瘟热病毒P1蛋白免疫BALB／c小鼠，并将其脾淋巴细胞与SP2／0进行融合，用CDV包被ELISA板，

用于质粒DNA规模化生产的大肠杆菌发酵培养基的筛选

为降低质粒DNA的生产成本,在标准LB培养基的基础上,利用国产试剂配制成10种大肠杆菌液体培养基,以pEGFPC3、pcDNAlacZ和pcDNKLYZ质粒转化的JM109和DH5α大肠杆菌为指示菌进行小规模发酵培养,定时采样测量OD600值及质粒产量,获得一种高性价比培养基。用该培养基培养重组大肠肝菌,绘制生长曲线,并于其对数生长中期进行42℃诱导。结果表明经42℃诱导后,重组大肠肝菌JM109和DH5α的质粒产量均有提高,重组JM109的产量比重组DH5α约提高20%,为低成本、大规模生产重组质粒提供了良好的技术保障。

犬细小病毒VP2抗体竞争ELISA检测方法的初步建立

本研究旨在制备犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2抗体,并建立竞争ELISA检测方法,从而为CPV疫苗免疫效果的检测及血清学调查提供技术支持。参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计1对添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,PCR扩增VP2基因全长序列,将其克隆到pET28a(+)载体中,构建原核表达载体pET28a-VP2,转化大肠杆菌Rosetta,表达并纯化了重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,目的蛋白分子质量大小为67ku,可被CPV抗血清识别,证明其能与特异性抗体结合,有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白免疫家兔制备VP2多抗,采用辣根过氧化物酶进行标记,初步建立了竞争ELISA方法。结果显示,VP2重组蛋白的最佳包被浓度为5μg/mL,酶标多抗的最佳稀释度为1∶3200,封闭条件为4℃过夜,最适的封闭液为10%小牛血清,山羊抗兔IgG-HRP的最佳工作浓度为1∶5000,显色时间为25min。竞争ELISA试验结果表明,该方法具有较强的稳定性,有望为CPV疫苗免疫效果的判定及血清学调查提供技术手段。

中药犬螨灵对犬蠕形螨的疗效试验

为筛选具有显著治疗犬蠕形螨的中药制剂,试验将中药小茴香、蛇床子、羊蹄根采用水煮醇沉及蒸馏等提取方法制备成中药制剂犬螨灵,并观察其对犬蠕形螨的疗效。将犬螨灵设为高、中、低3个浓度,其生药含量分别为2.0、1.0和0.5g/mL,采用点滴法进行体外抑杀蠕形螨试验,在此基础上对12只接种蠕形螨的试验犬进行治疗试验,为验证治疗效果,对临床上已确诊的45只患有蠕形螨的病犬分3组进行临床治疗试验。结果显示,中药犬螨灵3种剂量均有较强的体外抑杀螨虫作用,高剂量组作用后4h即可完全抑杀蠕形螨,1%伊维菌素对照组则为作用后8h;高剂量组在治疗3周后,患处有大量新毛生长,红疹结节和皮屑消失,患处皮肤已痊愈,1%伊维菌素治疗组患犬皮肤好转,仅有少量新毛生长,不能达到痊愈标准;高、中剂量组皮肤刮取物螨虫数量平均比例及停药1个月后复发率均为0,1%伊维菌素治疗组皮肤刮取物螨虫数量平均比例及停药1月后的复发率分别为10.63%和9.17%。高剂量中药犬螨灵与1%伊维菌素两种药物联合治疗组,对临床上患病犬进行3周治疗,其虫卵平均转阴率、治愈率与平均治愈天数分别为100.00%、93.33%和19.56d,其效果均优于中药犬螨灵与1%伊维菌素单独治疗组。结果表明,高剂量自制中药制剂犬螨灵对犬蠕形螨体外抑杀作用、接种蠕形螨试验犬与临床自然感染病例均有显著的治疗效果,优于1%伊维菌素对照组,犬螨灵作为中药杀螨虫制剂具有较好的市场开发前景。

CDV、CPV、CAV-2及CPIV多重PCR的建立及应用

为建立一种快速检测犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅱ型(CAV-2)和犬副流感病毒(CPIV)的多重PCR方法,参照Gen Bank中的相关病毒基因序列,分别设计了4对引物,用于特异性扩增CDV H基因、CPV VP2基因、CAV-2 E3基因和CPIV NP基因上的目的片段。通过优化反应条件,建立了同时扩增CDV(410 bp)、CPV(253 bp)、CVA-2(655 bp)和CPIV(868 bp)的多重PCR方法。利用建立的多重PCR方法,对CDV、CPV、CAV-2、CPIV、CDV+CPV+CAV-2+CPIV和犬冠状病毒(CCV)的DNA或c DNA模板进行扩增,发现该方法的特异性良好。利用建立的多重PCR方法与单一PCR方法进行敏感性比较,发现两者敏感性相差10倍,证明多重PCR方法敏感性良好。利用该方法对从北京市采集的30份犬病料样品进行检测,发现CDV阳性率为63.33%(19/30)、CPV阳性率为33.33%(10/30)、CAV-2阳性率为6.66%(2/30)、CPIV阳性率为0(0/30)。检测结果证明建立的多重PCR方法可用于临床诊断。

细粒棘球蚴EG95s重组蛋白串联表达免疫原性分析

目的比较、分析EG95s重组蛋白的免疫原性。方法本研究分别诱导表达含有1、2、3拷贝EG95s的pET-1EG95s、pET-2EG95s和pET-3EG95s重组质粒,并用His亲和纯化HIS-1EG95s、HIS-2EG95s和HIS-3EG95s3种重组蛋白。再以相同的免疫程序分别免疫8周龄BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法检测小鼠体内抗体水平的变化分析其免疫原性。结果经过改造的EG95s重组蛋白:HIS-1EG95s、HIS-2EG95s、HIS-3EG95s均保留了免疫原性,能诱导小鼠产生特异性抗体。3者抗体水平的比较结果显示HIS-1EG95s首次免疫后1周产生的抗体水平明显高于HIS-2EG95s、HIS-3EG95s,但免疫后2周开始,HIS-3EG95s抗体水平超过HIS-1EG95s组,并在二次免疫及三次免疫后持续高于HIS-1EG95s组。免疫后最终抗体效价显示HIS-1EG95s和HIS-2EG95s两组均为1∶819 200,而HIS-3EG95s组为1∶1 638 400。HIS-1EG95s、HIS-2EG95s、HIS-3EG95s均诱导机体产生IFN-γ,但差异不显著,与羊包虫阳性血清反应结果显示HIS-1EG95s的反应性均显著低于HIS-2EG95s和HIS-3EG95s。结论 HIS-1EG95s、HIS-2EG95s与HIS-3EG95s均具有很好的免疫原性,虽HIS-EG95s在免疫初期免疫效果好,但串联3拷贝的EG95s后使得重组蛋白免疫效果更持久,更有利于产生更长效的免疫保护作用。本研究为羊包虫病疫苗的研制及免疫预防奠定了科学基础。