目的研究尘螨肠道微生物蛋白Hypothetical protein CE2118的表达和纯化,为研究其在尘螨疫苗免疫治疗中的作用奠定基础。方法采用生物信息学方法,根据GenBank中Hypothetical protein CE2118蛋白的基因序列,将其中稀有密码子改造为大肠杆...目的研究尘螨肠道微生物蛋白Hypothetical protein CE2118的表达和纯化,为研究其在尘螨疫苗免疫治疗中的作用奠定基础。方法采用生物信息学方法,根据GenBank中Hypothetical protein CE2118蛋白的基因序列,将其中稀有密码子改造为大肠杆菌常用密码子并进行二级结构优化,合成Hypothetical protein CE2118基因,构建原核表达载体pGEX6P-1-hypothetical protein CE2118并经酶切鉴定,在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,重组产物采用GST亲和层析纯化柱纯化。结果经密码子改造和二级结构优化后Hypothetical protein CE2118基因长度为588bp,其编码蛋白理论分子量为21kDa。重组表达载体经酶切鉴定与理论推测结果相符,该基因经IPTG诱导在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中得到高效的可溶性表达,纯化后的重组蛋白分子量约为21kDa,其单一蛋白纯度达95%以上。结论本研究成功构建了Hypothetical protein CE2118基因的pGEX6P-1原核重组质粒,获得的可溶性重组蛋白为进一步研究肠道微生物蛋白Hypothetical protein CE2118在尘螨疫苗免疫治中的作用机理奠定基础。展开更多
目的克隆、表达屋尘螨3类变应原(Der p 3)基因,纯化Der p 3重组蛋白,对其免疫原性及生物信息学特点进行分析。方法取实验室纯培养的屋尘螨500只,提取总RNA,逆转录生成cDNA, RT鄄PCR扩增Der p 3基因。扩增的Der p 3基因经测序正确后,将...目的克隆、表达屋尘螨3类变应原(Der p 3)基因,纯化Der p 3重组蛋白,对其免疫原性及生物信息学特点进行分析。方法取实验室纯培养的屋尘螨500只,提取总RNA,逆转录生成cDNA, RT鄄PCR扩增Der p 3基因。扩增的Der p 3基因经测序正确后,将目的条带连接至pMD鄄32T载体中进行扩增,并利用限制性内切酶Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切,酶切后的片段连接至pET鄄32a表达载体,转化至大肠埃希菌Rosetta中,经1 mmol/L异丙基鄄β鄄D鄄硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,蛋白质印迹(Western boltting)分析重组蛋白的免疫原性。分别采用BLAST、 ProtParam、 PSIPRED、 SWISS鄄MODEL对重组蛋白的同源性、理化性质、二级结构、三级结构进行分析;通过BLAST和MEGA构建Der p 3的系统进化树;并利用IEBD和DNA Star对Der p 3重组蛋白的抗原表位进行预测。结果RT鄄PCR扩增屋尘螨Der p 3基因,得到约1 000 bp的片段,经测序为Der p 3目的序列,其开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸。经IPTG诱导后大量表达Der p 3重组蛋白。该蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量(Mr)约30 000。Western blotting分析结果显示,重组蛋白Der p 3能与10份尘螨过敏性哮喘患者血清IgE抗体特异性结合。BLAST和MEGA分析结果显示, Der p 3基因与粉尘螨3类变应原(Der f 3)的序列一致性较高,约80%。Der p 3蛋白较稳定,二级结构由螺旋、延伸链、随机线圈组成;并预测到6个抗原表位肽序列。结论纯化后的Der p 3重组蛋白能与尘螨过敏性哮喘患者血清IgE抗体特异性结合,具有较强免疫原性。展开更多
文摘目的研究尘螨肠道微生物蛋白Hypothetical protein CE2118的表达和纯化,为研究其在尘螨疫苗免疫治疗中的作用奠定基础。方法采用生物信息学方法,根据GenBank中Hypothetical protein CE2118蛋白的基因序列,将其中稀有密码子改造为大肠杆菌常用密码子并进行二级结构优化,合成Hypothetical protein CE2118基因,构建原核表达载体pGEX6P-1-hypothetical protein CE2118并经酶切鉴定,在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,重组产物采用GST亲和层析纯化柱纯化。结果经密码子改造和二级结构优化后Hypothetical protein CE2118基因长度为588bp,其编码蛋白理论分子量为21kDa。重组表达载体经酶切鉴定与理论推测结果相符,该基因经IPTG诱导在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中得到高效的可溶性表达,纯化后的重组蛋白分子量约为21kDa,其单一蛋白纯度达95%以上。结论本研究成功构建了Hypothetical protein CE2118基因的pGEX6P-1原核重组质粒,获得的可溶性重组蛋白为进一步研究肠道微生物蛋白Hypothetical protein CE2118在尘螨疫苗免疫治中的作用机理奠定基础。
文摘目的克隆、表达屋尘螨3类变应原(Der p 3)基因,纯化Der p 3重组蛋白,对其免疫原性及生物信息学特点进行分析。方法取实验室纯培养的屋尘螨500只,提取总RNA,逆转录生成cDNA, RT鄄PCR扩增Der p 3基因。扩增的Der p 3基因经测序正确后,将目的条带连接至pMD鄄32T载体中进行扩增,并利用限制性内切酶Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切,酶切后的片段连接至pET鄄32a表达载体,转化至大肠埃希菌Rosetta中,经1 mmol/L异丙基鄄β鄄D鄄硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,蛋白质印迹(Western boltting)分析重组蛋白的免疫原性。分别采用BLAST、 ProtParam、 PSIPRED、 SWISS鄄MODEL对重组蛋白的同源性、理化性质、二级结构、三级结构进行分析;通过BLAST和MEGA构建Der p 3的系统进化树;并利用IEBD和DNA Star对Der p 3重组蛋白的抗原表位进行预测。结果RT鄄PCR扩增屋尘螨Der p 3基因,得到约1 000 bp的片段,经测序为Der p 3目的序列,其开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸。经IPTG诱导后大量表达Der p 3重组蛋白。该蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量(Mr)约30 000。Western blotting分析结果显示,重组蛋白Der p 3能与10份尘螨过敏性哮喘患者血清IgE抗体特异性结合。BLAST和MEGA分析结果显示, Der p 3基因与粉尘螨3类变应原(Der f 3)的序列一致性较高,约80%。Der p 3蛋白较稳定,二级结构由螺旋、延伸链、随机线圈组成;并预测到6个抗原表位肽序列。结论纯化后的Der p 3重组蛋白能与尘螨过敏性哮喘患者血清IgE抗体特异性结合,具有较强免疫原性。
