截短型人Bid融合蛋白对HeLa细胞的促凋亡作用

目的 :观察截短型人bid及其N端融合蛋白的表达对HeLa细胞的促凋亡作用 .方法 :通过反转录PCR方法获取人全长bid基因 ,再经PCR方法克隆得到截短型bid(trun catedbid ,tbid)基因及其N端融合蛋白基因插入pcDNA3真核表达载体 ,脂质体法转染HeLa细胞 ,通过间接免疫荧光 ,电子显微镜以及流式细胞仪等方法观察被转染细胞的生长及凋亡状况 .结果 :成功获得人bid基因 ,构建了tbid基因及tbid与绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因的真核表达载体 (pcDNA3 tbid6 1 ,pcDNA3 PE tbid6 1 ) .与对照组相比 ,在转染后 1 2～ 4 8h内两种基因的表达均导致HeLa细胞发生凋亡 ,且两者活性相当 .结论

截短型人bid基因的克隆、表达和促凋亡作用的研究

目的 :探讨截短型bid(truncatedbid ,tbid)基因的表达对Hela细胞的促进凋亡活性。方法 :用RT PCR法克隆人全长bid基因 ,测序正确后 ,通过PCR截去编码N末端 6 0个氨基酸残基的基因 ,而获得tbid基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,用脂质体法转染Hela细胞。通过荧光显微镜、电子显微镜观察和TUNEL检测法 ,检测目的基因的表达对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果 :成功地构建了tbid基因的真核表达载体。以其转染Hela细胞后 ,tbid基因在细胞中得到表达 ,随后引起细胞荧光强度下降 ,生长状况不良甚至死亡。电镜观察及TUNEL检测的结果显示 ,许多细胞呈典型的凋亡特征。结论

骨肉瘤HER2基因表达增加肺转移发生危险度

目的:研究骨肉瘤中HER2基因表达与骨肉瘤患者发生肺转移的关系。方法:对43例骨肉瘤患者的临床病理资料进行回顾性研究,应用HER2单克隆抗体对组织切片进行免疫组织化学染色,并将上述资料与随访患者发生肺转移情况进行统计学分析。结果:骨肉瘤患者HER2表达与患者发生肺转移相关(P<0.05),HER2高表达的骨肉瘤患者发生肺转移的可能性大。结论:HER2检测是判断骨肉瘤发生肺转移的一项有价值的指标;同时,HER2基因为骨肉瘤的生物治疗提供一种可能的靶点。

HER2基因表达与骨肉瘤预后

目的:研究骨肉瘤中HER2基因的表达与临床预后的关系。方法:对82例骨肉瘤患者的临床病理资料进行回顾性研究,应用HER2单克隆抗体对组织切片进行免疫组织化学染色,并将上述资料与患者的预后进行分析。结果:骨肉瘤患者HER2表达与患者预后相关(P<0.05),HER2高表达的骨肉瘤患者预后较差。结论:HER2检测是骨肉瘤预后判断的一项有价值的指标;同时,HER2为骨肉瘤的治疗提供一种可能的生物靶点。

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的:构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促调亡作用。方法:通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪(FCM)检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因(PEⅡ)和tBid基因连接,构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv/tBid,将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv/tBid载体,转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化,Annexin V染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果:流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv/tBid。重组质粒转染E10细胞后,间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达;细胞色素C在细胞质中出现;细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。Annexin V染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高(16.1% vs 4.5%);TUNEL染色显示,E10细胞出现典型的凋亡特征。结论:重组抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达,并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。

重组LacZ复制缺陷型腺病毒的构建和鉴定

目的:构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。方法:用AdEasy-1TM系统,在大肠杆菌中同源重组,构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-LacZ)。重组腺病毒在HEK293细胞内包装并扩增,测定病毒滴度、电镜鉴定病毒存在、斑点杂交检测其复制缺陷性,然后感染HeLa细胞X-gal染色检测LacZ的表达情况。结果:成功构建了重组LacZ腺病毒表达载体,包装获得的重组腺病毒的滴度为1.58×109PFU/m l。在转染的细胞和感染的靶细胞内均可检测到LacZ的表达。电镜下可见感染的HEK293细胞核内含晶格状结构的腺病毒包函体。斑点杂交提示重组病毒为复制缺陷型,其基因转移百分率和感染强度和感染时间有一定的相关性。结论:成功构建了表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。

重组tBid融合蛋白基因的构建及其在HeLa细胞中的分泌表达

目的:构建重组的Immuno-tBid基因,并检测其在HeLa细胞中的分泌表达。方法:将肿瘤表面抗原HER2的单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PE253-364aa)和tBid基因连接,并在5'端连接前导肽基因,构建成Immuno-tBid(e23sFv-PEII-tBid61/tBid76)基因。将其克隆到pCMV载体并转染HeLa细胞,G418筛选获得阳性克隆,Genomic-PCR和RT-PCR分别扩增相应的重组基因片段。建株的HeLa细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测。并通过间接免疫荧光染色和细胞计数观察建株的HeLa细胞生长和形态变化。结果:成功构建了重组的Immuno-tBid基因的真核表达载体(pCMV-e23sFv-PEII(253-364)-tBid61/tBid76)。稳定转染HeLa细胞,获得G418抗性的阳性HeLa细胞克隆,Genomic-PCR检测证实目的基因已整合到细胞基因组中。RT-PCR检测表明目的基因在RNA水平上的表达。细胞培养上清进行蛋白G琼脂糖凝胶免疫沉淀,Western Blot检测,证实建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。间接免疫荧光染色和核染色结果显示,分泌Immuno-tBid蛋白的HeLa细胞呈标准的S型曲线生长,形态正常。结论:成功构建了重组的Immuno-tBid基因,建株的HeLa细胞可以通过分泌途径产生Immuno-tBid蛋白。

重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用

目的构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，并探讨其对骨肉瘤E10细胞的促凋亡作用。方法通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪（FCM）检测E10细胞膜表面HER2的表达。将抗HER2单链抗体基因e23sFv与铜绿假单胞菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和tBid基因连接，构建抗HER2重组融合蛋白基因ScFv／tBid，将其克隆入真核表达载体pCMV中构建重组pCMV-ScFv／tBid载体，转染骨肉瘤E10细胞。间接免疫荧光法检测目的蛋白表达和细胞形态学变化，AnnexinV染色流式细胞术及TUNEL法检测E10细胞的凋亡情况。结果流式细胞仪检测到E10细胞膜表面有HER2的表达。成功构建重组融合蛋白基因质粒pCMV-ScFv／tBid。重组质粒转染E10细胞后，间接免疫荧光双标记染色检测到E10细胞中tBid的过表达；细胞色素C在细胞质中出现；细胞出现明显的固缩、核浓缩等形态特征。AnnexinV染色后流式细胞仪检测可见实验组细胞凋亡率较对照组明显升高（16．1％VS4．5％）；TUNEL染色显示，E10细胞出现典型的凋亡特征。结论重组抗HER2融合蛋白基因ScFv／tBid可以在转染的骨肉瘤E10细胞中表达，并诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。

成骨肉瘤细胞SOSP-9607中miRNA的克隆与验证

背景与目的:microRNA(miRNA)是一类非编码蛋白,并参与转录后调节的单链小分子RNA(约20～25个碱基),对基因表达具有重要调控作用,与肿瘤的发生存在着密切的关系。本研究拟克隆成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中miRNA,并对部分功能性基因进行验证。方法:以SOSP-9607细胞作为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),多聚腺苷酸化和5′连接子连接后,通过RT-PCR进行反转录和扩增,克隆到pCR4-TOPO载体上得到大约109bpDNA片段,测序后经过生物信息学分析确定miRNA的表达情况。根据当前miRNA的研究现状,在克隆到的miRNA中选取部分功能性miRNA和新发现miRNA,合成相应探针后与从SOSP-9607细胞、HeLa细胞和成骨肉瘤组织中分离出的小片段RNA进行Northern印迹验证。结果:克隆测序后得到182个克隆体,经生物信息学分析发现有47个miRNA(25种),其中含有23种已知的miRNA和2种Nature杂志上预测的miRNA(miR-165和miR-166)。选取的三条实体瘤相关的miRNA(miR-21、miR-20a、miR-17-5p)以及两条预测的miRNA进行Northern印迹验证,miR-21、miR-20a、miR-17-5p在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中均表达,预测的miR-165和miR-166在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中亦均表达,但miR-166在HeLa细胞中没有表达。结论:克隆了SOSP-9607细胞中的miRNA,并验证了部分功能性miRNA的表达,提示miRNA与肿瘤发生可能有密切的关系。

复合骨形成蛋白骨修复材料的生物相容性研究

目的 :近年来脱钙骨基质颗粒复合骨水泥已用于修复微波诱导高温原位灭活骨肿瘤性骨缺损 ,在此基础上再复合骨形成蛋白可提高其成骨诱导活性。为推广临床应用 ,本文拟对其生物相容性进行研究。方法 :制备脱钙骨基质颗粒 ,提取牛骨形成蛋白 ,与骨水泥按不同质量比复合后植入小白鼠腹腔内行急性、亚急性毒性试验 ,植入小白鼠后腿股部肌肉内行肌肉刺激试验 ,体外行溶血、凝血试验和骨内埋入试验。结果 :急性毒性试验动物无死亡 ,亚急性毒性试验术前、术后动物体重、红细胞、白细胞和血红蛋白无统计学差别 (t检验 ,P >0 .0 5 ) ,对肌肉无刺激 ,体外对溶血、凝血功能无影响 ,植入骨内无不良反应 ,6个月即可与宿主骨形成“生物铆定”。结论 :该复合材料生物相容性好 ,易塑形 ,具有很强的成骨诱导活性 ,能满足修复不同部位。

miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。

利用基因芯片技术筛选不同转移能力骨肉瘤细胞差异表达基因

目的 :运用基因芯片技术研究骨肉瘤转移相关基因表达 .方法 :提取具有不同转移特性的骨肉瘤细胞总RNA ,反转录制备杂交探针 ,应用基因芯片筛选与骨肉瘤转移相关的基因 .杂交信号用ScanArray 30 0 0扫描 ,结果用ImaGene3.0软件分析 .结果 :对原位及转移骨肉瘤细胞基因表达谱分析 ,发现两种肿瘤细胞中存在差异表达基因 ,其中有抑癌基因、转移相关蛋白基因、细胞周期蛋白基因等 ,与肿瘤发生发展密切相关 .结论

1株人成骨肉瘤细胞系的建立及特性观察

引言成骨肉瘤是人类最常见的原发性恶性骨肿瘤，死亡率、致残率很高．建立该肿瘤的细胞系，有助于对其深入研究，我们新建立了１株人成骨肉瘤细胞系，体外已传１２０余代，现报告如下．１方法１．１组织来源标本取材于１７岁男性患者１９９６－０７－１６的截肢，病理诊断...

骨形态发生蛋白复合材料修复狗股骨微波灭活骨缺损的实验研究

用脱钙骨基质颗粒、骨水泥和骨形态发生蛋白复合后的材料修复狗股骨微波诱导高温原位灭活骨缺损。显露狗右侧股骨中段 ,微波诱导高温 5 0℃、2 0min原位灭活 ,造成 2 5cm× 1 0cm骨缺损 ,植入复合材料 ,左侧单纯植入骨水泥做对照。分别于术后不同时间行X线照相、99mTc MDP骨显像、组织学观察和生物力学测定。结果发现 ,该复合材料极易塑形 ,能用于修复各种形状的骨缺损并能早期负重 ,其内部存在有利于新生血管长入的不规则间隙 ,最终与宿主骨达到“生物铆定”。

插入式微波天线阵列诱导高温原位灭活治疗肢体恶性或侵袭性骨肿瘤

评价插入式微波天线阵列诱导高温原位灭活治疗肢体恶性或侵袭性骨肿瘤保肢手术的临床应用．方法：应用插入式微波天线阵列诱导高温原位灭活治疗肢体恶性或侵袭性骨肿瘤19o例．从手术技术、肿瘤学、关节功能、并发症等方面全面综合评价此方法的临床应用效果．结果：恶性骨肿瘤134例，术后平均随访47mo，因远隔脏器转移死亡者32例，另有3例虽有肺部转移，但经转移病灶切除后现仍无瘤存活；存活率为74．2％；IO2例存活者中肢体关节功能优者72例，良者14例．骨巨细胞瘤56例，术后平均随访49mo，l例死于肺转移；3例局部复发，经行瘤段截除大段异体骨移植后治愈；35例关节功能属优，21例为良．结论：插入式微波天线阵列诱导高温原位灭活治疗骨肿瘤技术是一种创新的、有效安全的、临床效果显著的、治疗肢体恶性或侵袭性骨肿瘤的新手段，值得继续应用、改进和评价这一治疗体系．

骨盆环区域骨肿瘤的外科治疗

评价半骨盆截除术、内半骨盆切除体外灭活再植或单纯旷置术、插入式微波天线阵列诱导高温原位灭活水治疗骨盆部骨肿瘤；部分切除术及前后联合入路局部刮除并辅助以局部单纯放疗或（和）置管持续灌注化疗术治疗舱骨肿瘤的效果．探讨骨盆环区域骨肿瘤的各种外科治疗方法的优缺点，以便更有效地治疗该部位肿瘤．方法：7a中外科治疗骨盆环区域各类良、恶性骨肿瘤146例，其中应用半骨盆截除术治疗晚期骨盆骨肿瘤44例；内半骨盆切除体外灭活再植或单纯旷置术治疗骨盆部骨肿瘤Ic例；插入式微波天线阵列诱导高温原位灭活术治疗骨盆部骨肿瘤42例；部分切除术及前后联合入路局部刮除术后局部单纯放疗或（和）置管持续灌注化疗术治疗各类船骨肿瘤SO例．平均随访3a以上，从肿瘤学、肢体关节功能学、并发症等方面综合评价上述各种外科治疗方法的代、缺点．结果：44例半骨盆截除患者仅存活16例．仅有少数年轻患者术后可佩带假肢行走，但步态极差；内半骨盆截除后体外灭活再植或旷置水1o例患者中，复发1例；死亡2侧；感染3例；肢体关节功能优良率为4o％．应用插入式微波天线阵列诱导高温原位灭活治疗骨盆骨肿瘤42例；8例局部复发，其中5例死亡．其余34例中肢体关节功能25例为优。9例尚可．2例感染，1例坐骨神经热损伤．

microRNA-192抑制物对骨肉瘤细胞系SOSP_9607增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-192抑制物对于骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖和凋亡的影响。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡和周期。将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-192抑制物(hsa-miR-192inhibitors)抑制SOSP_9607细胞内miR-192的活性。结果:与对照组相比,实验组显著抑制SOSP_9607细胞的增殖,有明显的剂量依赖性(P<0.01)。随着浓度从50nmol/L逐渐增加至200nmol/L,抑制率逐渐增高(P<0.01)。与对照组相比,实验组细胞周期G_0/G_1细胞比例显著增加,G_2/M期细胞比例显著减少,S期细胞比例显著减少(P<0.01)。实验组凋亡率(13.6±2.1)%与阴性对照组凋亡率(7.1±0.5)%相比明显增高(P<0.01)。结论:miR-192抑制物通过抑制SOSP_9607细胞中miR-192的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡发挥重要作用,可能成为骨肉瘤生物治疗的新靶点。

局部及已转移骨肉瘤中VEGF、p53表达及微血管生成的对照研究(英文)

目的 探讨血管内皮生长因子 (VEGF)和p5 3在骨肉瘤微血管新生中的作用及对原发骨肉瘤侵袭性转移性的影响。方法 采用免疫组织化学方法 ,检测 5 7例局部原发性骨肉瘤和 2 7例伴发转移的骨肉瘤原发灶标本中VEGF、p5 3的表达 ,计算MVD值。比照两骨肉瘤组中VEGF、p5 3表达 ,MVD以及其它临床病理因子的差别。结果 伴发转移骨肉瘤组VEGF阳性表达率高于局部骨肉瘤组 (P =0 .0 4 94 ) ;p5 3蛋白表达在两组肿瘤中无显著差别 (P <0 .0 5 ) ;伴发转移骨肉瘤组的微血管密度高于局部骨肉瘤组的微血管密度 (P =0 .0 30 2 ) ;伴发转移骨肉瘤组中肿瘤平均直径大于局部骨肉瘤组的平均直径 (P =0 .0 35 0 ) ;VEGF和P5 3表达阳性组与阴性组相比 ,MVD值高 (P =0 .0 12 5 ,P =0 .0 0 36 ) ;VEGF与P5 3表达阴阳性一致率为 5 1.2 %。VEGF和P5 3共同阳性表达组MVD值最高 (4 2 .7± 2 2 .4 ) ,而VEGF和P5 3共同阴性表达组MVD值为最低 (2 3.3± 2 0 .1) ,差别显著 (P =0 .0 0 77)。结论 p5 3和VEGF共同参与骨肉瘤血管生成并有协同作用。VEGF和MVD检测对骨肉瘤早期转移的临床预测有实际意义。