信号转导与血小板激活

血小板通过一系列信号转导机制 ,主要包括磷脂酶C β(PLC β)通路、酪氨酸蛋白激酶 (PTK)通路、磷脂酰肌醇 3激酶 (PI3 K)通路、丝裂原激活的蛋白激酶 (MAPK)通路、环磷酸腺苷 蛋白激酶A(cAMP PKA)通路和磷脂酶A2 (PLA2 )花生四烯酸通路等介导被激活。本文就血小板信号转导及其激活作一概述。

新型冰冻红细胞洗涤机洗涤效果的研究

目的研制一种全自动、封闭式,体积小、重量轻,洗涤程序设计简单的新型冰冻红细胞洗涤机。方法全血采自健康献血者,ACD抗凝,离心获浓缩红细胞,加入甘油到终浓度为40%,-80℃保存。42℃条件下冻融红细胞,利用自行设计的透析式新型冰冻红细胞洗涤机,使用3种自动化洗涤程序洗涤红细胞,直至可输注。结果洗涤后红细胞形态正常,3种程序洗涤后红细胞的回收率(%)分别为69.73±8.36,85.09±6.03和88.43±4.72;红细胞血红蛋白的回收率(%)分别为45.30±2.66,70.80±3.76和81.26±5.55;洗后上清液中游离血红蛋白的含量(g/L)为0.20±0.08,0.14±0.03和0.25±0.13,采用单因素k水平方法对数据进行统计学分析,得出了最佳洗涤程序。结论该新型冰冻红细胞洗涤机采用优化的洗涤程序,洗涤后的冰冻红细胞达到了国家的质量标准。

探究初中数学教学中如何培养学生的逆向思维能力

逆向思维是一种高级的思维方式,在数学学习中具有重要意义。随着新课程改革的不断推进,学生思维能力的培养成为教学的重点,同时也对教师的教学方式提出了更高的要求。因此,教师应充分认识逆向思维对学生数学学习的重要性,革新教学思想和模式,帮助学生在学习中逐步学会用逆向思维处理数学问题,形成良好的逆向思维能力。文章结合自身教学经验和相关理论知识,就如何利用逆向思维提高初中数学课堂教学效果进行探究。

细胞角蛋白19启动子调控的双报告载体的构建及其在肝干/祖细胞分化研究中的应用

肝干/祖细胞是肝细胞和胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs)共同的前体细胞,为了对这一前体细胞的分化情况进行研究,利用报告基因来监测肝干/祖细胞的分化走向.首先,通过PCR方法从肝癌细胞系HepG2的全基因组中克隆了细胞角蛋白19(CK19)启动子片段,构建了CK19启动子调控的海肾荧光素酶和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)双报告载体(pSicoR-CK19-hrl-mrfp).其次,将上述慢病毒载体转染肝干/祖细胞后,通过流式细胞分选获得稳定转染的细胞株.再次,将上述细胞株与表达"上皮形态发生素"(Epimorphin,EPM)的PT67细胞共培养后,整合有pSicoR-CK19-hrl-mrfp表达载体的肝干/祖细胞不仅形态发生了变化,而且排列为二维环状结构,另外还检测到由CK19启动子启动表达的海肾荧光素酶和RFP,细胞形态和基因表型都证明肝干/祖细胞经诱导已经分化成为BECs.与此形成对照的是肝干/祖细胞与不表达EPM的PT67细胞共培养后,没有观测到上述的变化.所以,CK19启动子调控的双报告载体不仅可以实时地显示肝原始细胞在不同的诱导环境下的分化走向,而且还可以定量地检测CK19启动子活性的变化情况.总之,这一载体的成功构建将为研究肝干/祖细胞的分化提供了便捷的工具,同时也有助于筛选可诱导肝干/祖细胞定向分化的分子.

用慢病毒转染RNAi技术沉默胆固醇7α羟化酶的基因表达,降低肝细胞中胆汁酸的分泌

为了降低生物人工肝(bioartificial liver system)中肝细胞胆汁酸的分泌,构建了胆固醇7α羟化酶慢病毒RNA干涉载体,并转染人肝脏细胞(L-02)。根据绿色荧光蛋白的表达评估转染效率后进行流式分选,获得高表达慢病毒干涉载体的细胞,并以野生型L-02细胞和仅转染pSicoR空载体的L-02细胞作对照,观察肝细胞胆固醇7α羟化酶的表达以及培养上清中总胆汁酸含量。利用半定量PCR、实时荧光定量PCR及Western-blot等实验方法检测了转染细胞中基因的干涉效果,结果显示:与对照组相比,在mRNA水平,转染慢病毒siRNA载体的L-02细胞,其胆固醇7α羟化酶基因的表达量仅为野生型L-02细胞表达量的31.2%,为转染pSicoR空载体的L-02细胞的34.1%,干涉效率分别为68.8%和65.9%,均具有显著差异(P<0.05);Western-blot结果显示胆固醇7α羟化酶在蛋白质水平表达也明显受到抑制,表明转染慢病毒siRNA下调了肝细胞中胆固醇7α羟化酶基因的表达,减少了胆汁酸的分泌。以上研究结果表明,利用RNAi技术可以获得低表达胆固醇7α羟化酶基因的肝细胞,并有效降低肝细胞中胆汁酸的分泌,为临床上生物人工肝的构建及应用奠定基础。

冷冻干燥血小板保存技术研究

为了探索新的血小板保存方法,对血小板进行了冷冻干燥的研究。采用乙醛对血小板做预处理,在冷冻干燥过程中为了稳定血小板的结构,加入了人白蛋白或海藻糖作为保护剂,并对再水化液进行了筛选。对冷冻干燥后的血小板进行了形态学观察和表面膜糖蛋白表达的检测。结果表明,乙醛处理后血小板的回收率基本稳定在60%以上,血小板的聚集活性与处理前相比有轻微的降低;5%人血白蛋白冷冻干燥保护液的保存效果明显优于40mmol/L海藻糖冷冻干燥保护液,在血小板聚集活性保持方面,用贫血小板血浆(PPP)再水化结果明显优于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。透射电子显微观察显示,冷冻干燥后血小板胞内细胞器和颗粒物质清晰可见,其中包括线粒体和各种分泌颗粒。乙醛处理后血小板膜糖蛋白的表达与新鲜血小板相比明显降低。结论:乙醛作为一种新的保护剂,对血小板冷冻干燥有良好的效果,值得进一步研究。

信息技术在小学美术课堂中的运用——以浙美版四年级下册《安全标识》一课为例

将信息技术引入美术课堂能够提升教学效率。在美术课堂上,教师可以利用信息技术丰富的教学辅助功能,激发学生的学习兴趣,丰富课堂的教学形式。以浙美版四年级下册《安全标识》一课为例,教师应借助生动的影像,凸显美术课程的视觉性;巧用在线连接,增强美术课程的实践性;善用激励,提升美术课程的愉悦性。实践证明,利用信息技术能够有效实现师生互动和生生互动,提高美术课堂教学的实效性,达到以美育人的目标。

双减背景下初中数学课堂教学模式改革路径探析

“双减”政策下,各学科的教学改革都发生了改变。初中阶段,数学科目非常重要,如果教师不改变课堂教学模式,课堂教学效率无法提升。双减政策对课外作业以及课堂教学都有明确的规定,所以教师要充分利用课堂时间,改革数学课堂模式,提高教学效率,增强学生综合素质,创造良好的课堂氛围。本文主要介绍双减背景下初中数学课堂教学模式的具体改革路径。

逆转录病毒介导的稳定表达E4orf1和绿色荧光蛋白的胎肝窦内皮细胞株的建立

目的:为构建优化的内皮细胞用于造血干细胞(HSCs)的支持培养,通过逆转录病毒载体系统建立稳定表达腺病毒E4区开放读框1(E4orf1)和绿色荧光蛋白(GFP)的人胎肝窦内皮细胞(HFLSECs)株。方法:利用Plat-A细胞将质粒MSCV-N E4orf1和p MX-GFP分别包装为逆转录病毒,共同感染HFLSECs,将原代培养的HFLSECs和转基因的HFLSECs分别在含有0.5、1、2、4μg/m L嘌呤霉素的EGM-2培养基中培养,以测试最适药物筛选浓度,药筛1周后通过流式细胞分选获得稳定转染E4orf1的GFP^+HFLSECs(E4orf1-GFP/HFLSECs)。通过密度梯度离心法从脐带血中分离单个核细胞,利用免疫磁柱分选获得CD34^+造血干/祖细胞(HSPCs),以E4orf1-GFP/HFLSECs作为饲养层联合SCF、TPO、Flt-3L等3种基础造血相关因子进行体外扩增和半固体造血细胞集落培养。结果:0.5μg/m L嘌呤霉素在5 d内即能完全杀死HFLSECs,而转基因的HFLSECs可以正常存活,以此药物浓度加压筛选1周,后续通过流式分选GFP阳性细胞,阳性率为90.5%,在E4orf1-GFP/HFLSECs饲养层支持下,人脐带血来源的CD34^+细胞15 d扩增了360倍,是单纯细胞因子悬浮培养组的2.2倍,且扩增后的HSPCs在体外仍具有多种造血集落形成能力。结论:该细胞株的建立将为构建造血干细胞体外培养体系及研究造血细胞的发育分化提供适宜的微环境。

人胚胎干细胞体外诱导分化为肝脏细胞

建立诱导人胚胎干细胞分化为肝细胞的方法,为细胞移植与生物人工肝等肝病替代治疗提供新的种子细胞来源.将人胚胎干细胞在细菌培养皿中悬浮培养7d,形成囊性拟胚体,接种至包被有Ⅰ型胶原的组织培养皿,以含有地塞米松、胰岛素的条件培养液进行诱导,通过光学显微镜和电子显微镜观察细胞的形态变化;免疫细胞化学和RT-PCR检测细胞诱导前后肝细胞特异性基因的表达;用靛青绿摄取、排泌实验、糖原染色实验及白蛋白、尿素分泌检测肝细胞的相关功能.条件诱导液培养14d,细胞形态由圆形变为多角形和长梭形,出现双核或多核,表面有微绒毛,胞浆内含丰富的线粒体、内质网、溶酶体及糖原颗粒等;这些细胞表达幼稚或成熟肝细胞特异性的AFP,ALB,CK18,CK19和CYP1B1等基因,并具有靛青绿摄取、排泌、贮存糖原和分泌白蛋白、氨基代谢生成尿素等功能.形态、表型及功能的实验结果均证实人胚胎干细胞经上述方法培养可以向肝细胞分化.

胚胎干细胞：从基础到临床有多远

尽管随着医学技术的快速发展，越来越多的疾病被彻底征服，然而，组织、器官的不可逆损伤或功能衰竭仍是困扰人类健康的世界性医学难题。全世界每年有数以百万计的患者因为遭受各种形式的疾病及创伤，导致组织器官和功能丧失，需要进行移植重建。但令人遗憾的是，组织、器官移植作为一种替代治疗方法，尽管有其巨大的治疗作用，但仍然是一种“拆东墙补西墙”的有损伤和有代价的治疗方法，很难满足临床救治工作的需要。

胚胎干细胞向肝系细胞定向分化及其在肝再生中的应用

细胞移植和生物人工肝(bioartificial liver,BAL)作为终末期肝病的辅助治疗方法,在越来越受到广泛关注的同时,也面临着细胞来源、数量限制、存活期短、功能迅速降低等问题,因此迫切需要寻找新的、合适的细胞来源.胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)是从囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)中分离获得的、具有无限增殖能力和分化全能性的原始细胞,能在特定的诱导条件下分化成各种组织特异性细胞,在临床上具有极其广阔的应用前景,其向肝系细胞的定向分化使其可能成为肝脏细胞移植和BAL的一个重要细胞来源.目前,研究重点在于控制分化过程以获得足够数量的所需类型细胞.本文概括了肝脏的发育与分化,综述了ESC向肝系细胞定向诱导分化的最新研究进展,并对其在肝再生中的应用和存在问题也进行了探讨,希冀对该领域的研究提供一些新的思路.

知母皂苷AⅢ抗血栓作用研究

目的:确定知母皂苷AⅢ体内、外给药对大鼠血小板聚集和血栓形成的抑制作用。方法:比浊法测定血小板聚集,动-静脉旁路血栓模型测定大鼠在体血栓的形成。结果与结论:体外血小板聚集模型研究证明,知母皂苷AⅢ可以抑制由ADP、胶原和凝血酶诱导的大鼠血小板的聚集,并呈剂量效应。体内给药同样可以有效抑制血小板的聚集率,当给药剂量达到40 mg/kg.d-1时对血小板聚集的抑制率可以达到26.7%。动-静脉旁路血栓形成实验结果显示,知母皂苷AⅢ体内给药可减小血栓的湿重和干重,说明知母皂苷AⅢ体内给药具有抗血栓的作用。知母皂苷AⅢ体内给药不影响出凝血时间。推测其抗血栓形成的功效可能是通过抑制血小板的黏附、聚集和活化而实现的。

肝细胞条件培养液对人脂肪间充质干细胞向肝细胞分化和增殖的作用

目的探讨人脂肪间充质干细胞在改良的诱导体系下向肝细胞的分化和增殖情况，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法从人脂肪组织分离出脂肪间充质干细胞，用含有碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4的肝细胞诱导液进行诱导，并于诱导7d后加入抑瘤素M。用细胞计数试剂盒-8法检测整个诱导过程细胞的增殖情况；通过光学显微镜观察诱导细胞的形态变化；用RT—PCR法和免疫荧光法分别检测肝细胞特异性基因和蛋白的表达；并对多种肝细胞特异性功能进行检测。组问比较采用t-test检验。结果用改良肝细胞诱导液培养的人脂肪间充质干细胞在培养第5、7、14、21天时，细胞数均明显多于用对照培养液培养的细胞（f值分别为6．59、8．69、15．94和24．64，P值均〈0．05）。诱导细胞表现出上皮样肝细胞形态；表达肝细胞特异性基因和蛋白；具有多种肝细胞特异性功能，如靛青绿摄取／排泌、糖原合成以及白蛋白分泌功能。结论人脂肪间充质干细胞在含碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4和抑瘤素M的诱导体系中能够分化为更加成熟的具有多种肝细胞特异性功能的细胞，且此诱导体系同时具有促进细胞增殖的作用。

脂肪来源干细胞的多向分化性及其在组织工程中的应用

近期研究表明间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)可以从脂肪组织获得,这类细胞被称为脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)。ADSCs与骨髓来源MSC具有相似的多向分化性,并且存在容易获取、取材创伤小和细胞获得量大等优点,因此有望成为组织工程中另一种很有前景的种子细胞来源。本文介绍了ADSCs多向分化性的最新研究进展,以及在各种组织工程中的应用情况。