全基因组测序技术在口岸耐多药肺结核诊断中的应用探索

目的探索全基因组测序(whole generation sequencing,WGS)技术在口岸耐多药(multidrug resistant,MDR)肺结核(pulmonary tuberculosis,PTB)诊断中的应用价值。方法自广州国际旅行卫生保健中心结核生物样品库中整理出单异烟肼耐药(isoniazid mono-resistant,HR)、单利福平耐药(rifampicin mono-resistant,RR)、MDR和广泛耐药(extensively drug resistant,XDR)4类耐药(drug resistant,DR)结核分离株92株,随机选取46株临床敏感菌株,菌种复苏后经液体比例法药物敏感性试验(drug resistant test,DST)和分子线性探针(line probe array,LPA)进行菌种鉴定、筛选和耐药性确认后,78株结核耐药菌株和43株全敏感菌株进行WGS检测,测序结果为非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria,NTM)/结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)混合感染4株,最后可纳入耐药分析菌株117株。以DST结果作为参考标准,比较WGS和LPA在口岸肺结核及其耐药性检测中的效能。结果WGS SE50检测系统对单菌的NTM/MTB混合感染具有很好的鉴别作用,对常见基因突变katG_S315T1、rpoB_S531L等均可稳定检出,gyrA_S95T和katG_R463L双突变可能导致MDR-TB及以上耐药。结论单末端(single-end,SE)50 WGS-DNA纳米球(DNA nanoball,DNB)检测分析系统用于口岸MDR-TB的诊断具有良好的可行性。

基于转录组学的生脉饮抗登革1型病毒作用机制研究

目的基于转录组学分析生脉饮抗登革1型病毒(DENV-1)的作用及其机制。方法采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和细胞凋亡检测试剂盒检测生脉饮对C6/36、293、LO2、HBMEC和AC16细胞的增殖、凋亡及毒性作用,使用C6/36细胞验证生脉饮对DENV-1的抑制作用。将LO2细胞分为4组,包括正常对照组、DENV-1感染组、利巴韦林处理组和生脉饮处理组,处理24 h后,收集细胞进行转录组测序,检测不同组之间的差异基因,并进行GO和KEGG富集分析。结果MTT结果显示生脉饮对不同细胞的半抑制浓度为17.5 mg/mL,4 mg/mL生脉饮对C6/36、293、LO2、HBMEC和AC16细胞的细胞凋亡无显著影响。转录组测序筛选到正常组与DENV-1组差异基因3995个,生脉饮组和DENV-1组差异基因3228个。生脉饮通过影响细胞周期、DNA复制、蛋白翻译、病毒转录等生物过程,以及调节p53、FoxO等信号通路,从而抑制DENV-1感染细胞。结论通过转录组测序分析表明,生脉饮通过调节多条信号通路抑制DENV-1感染细胞。

柴石解毒颗粒对感染登革2型病毒的1型干扰素受体阻断小鼠疗效的研究

目的:验证柴石解毒颗粒的有效性及机制,尝试使用初步建立的抗体阻断1型干扰素受体C57BL/6小鼠模型进行药物效果评价。方法:将3周龄的C57BL/6小鼠在攻毒前1天进行2.5 mg的1型干扰素受体抗体的腹腔注射,随后进行4×10;PFU DENV-2 NGC株的攻毒,攻毒后第1天开始进行2次/d的灌胃给药、症状观察、血清中病毒滴度及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平的测定,最后对感染小鼠脑、肝、肾、脾进行组织病理学分析。结果:中药组小鼠体内血清病毒滴度水平与模型组比较低且平缓,感染后6 d内处于1×10;copies/mL的数量级,没有出现突然上升的现象;与仅攻毒对照组、完全对照组比较,体质量增加虽受到了一定抑制,但较阳性药组显著增加(P<0.05)。同时,中药组血清中TNF-α、IL-6水平分别于感染后第4、6天显著低于模型组(P<0.05)。脑部和肾脏病理分析结果显示阳性药组病变最严重,其次为模型组,最轻微为中药组。结论:该方的应用,使得小鼠体内的血清中病毒滴度处于平缓状态,同时避免了炎症因子水平过激的情况。

寨卡病毒检测技术研究进展

近年来寨卡病毒肆虐,引起全球广泛关注。由于寨卡病毒的血清学检测容易和其他黄病毒产生交叉反应,故急需建立特异有效的检测技术用于寨卡病毒病的防治和研究。本文介绍了寨卡病毒的特点,并对感染者不同检测样品的特性、核酸及免疫学检测技术研究进展进行综述。

亚洲型寨卡病毒实时荧光定量PCR检测方法建立

目的分析亚洲型寨卡病毒基因组序列特征,建立亚洲型寨卡病毒的荧光定量PCR检测技术。方法通过分析亚洲型寨卡病毒全基因组核酸序列,选取亚洲型寨卡病毒的保守区设计引物和TaqMan探针,建立标准曲线并检测其特异性与敏感性。结果荧光定量PCR测试结果表明所设计的引物和探针特异性良好,对非洲型寨卡病毒、Ⅰ～Ⅳ型登革病毒和丙型肝炎病毒核酸检测无交叉反应;同时灵敏度较高,可达3.415×10~0 copies/μL;构建了标准曲线,回归方程为Y=–3.227 3logX+38.79,相关系数R^2=1,扩增效率E=102%。结论建立了一种检测亚洲型寨卡病毒的荧光定量PCR技术,可用于临床亚洲型寨卡病毒感染患者的病原分型、早期诊断及预防。

IFITM3调控流感病毒感染小鼠肺组织NLRP3炎症小体活化的研究

目的探讨干扰素诱导的跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)在流感病毒感染过程中对肺组织NLRP3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体活化的调控作用,为流感的防治提供新的思路。方法构建IFITM3敲除小鼠(Ifitm3^(-/-)小鼠),用A/AiCHi/1968/2(H3N2)病毒分别感染Ifitm3^(-/-)小鼠与野生型小鼠,连续14 d记录体重变化并计算存活率。在感染后第0、1、3和5 d采集小鼠肺组织,通过病理组织切片考察小鼠肺组织的病理损伤,采用Western blot、RT-qPCR、Elisa法检测小鼠肺组织的NLRP3炎症小体激活状况。采用SPSS 20.0软件进行独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果经A/AiCHi/1968/2(H3N2)病毒感染后,Ifitm3^(-/-)小鼠相比野生型小鼠表现出高的死亡率和更严重的肺组织炎症反应。较野生型小鼠而言,Ifitm3^(-/-)小鼠肺组织中NLRP3炎症小体效应蛋白NLRP3和caspase-1的基因和蛋白表达水平显著上升(P<0.05),同时NLRP3炎症小体下游因子IL-1β的mRNA拷贝数及分泌含量亦明显升高(P<0.05)。结论敲除IFITM3基因促使流感病毒感染小鼠肺组织NLRP3炎症小体的活化程度升高,首次发现在流感病毒感染时IFITM3参与了NLRP3炎症小体活化的调控过程,为IFITM3拮抗流感病毒的分子机制提供了新的线索。

构建表达绿色荧光蛋白的登革病毒克隆质粒

目的构建表达绿色荧光蛋白的登革病毒感染性克隆质粒,为药物研究以及病毒生命周期的研究奠定基础。方法利用重叠延伸PCR技术将绿色荧光蛋白基因插入登革病毒蛋白水解位点处,并用双酶切和测序鉴定构建的质粒。结果成功获得含有绿色荧光蛋白基因的登革病毒嵌合质粒,双酶切和基因测序确定已将绿色荧光蛋白基因插入登革病毒质粒中。结论成功获得了带有绿色荧光蛋白基因的登革病毒全长感染性克隆质粒。