CRISPR-Cas13a抑制RNA病毒的多靶标基因编辑技术构建

CRISPR-Cas适应性免疫系统为细菌和古细菌免受外来核酸和噬菌体的侵害提供了保护。其中2类VI-A型CRISPR-Cas效应子Cas13a(之前称为C2c2),可受CRISPR RNA的引导,靶向切割与原始间隔区反向互补的单链RNA。本研究利用CRISPR-Lsh-Cas13a系统,多靶标编辑烟草花叶病毒(TMV)RdRP、MP和CP基因,以抑制病毒在寄主烟草体内的侵染与扩散,从而达到保护寄主的作用。该系统在瞬时表达测定中表现出对野生型TMV-U1和表达绿色荧光蛋白的TMV-30b的干扰以及对病毒累积和病毒病症状的抑制。靶向TMV RdRP基因的CRISPR RNA表现出比靶向MP和CP基因更好的编辑效能。经过适当设计的CRISPR-Lsh-Cas13a系统被赋予了广谱抗性,可以特异性编辑多种TMV菌株。研究表明,CRISPR-Cas13a系统可以用于针对RNA病毒的抑制干扰。

不同温度下TMV侵染枯斑三生烟的LncRNA差异表达

【目的】筛选不同温度下烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染后枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var.Samsun NN)差异表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),研究lncRNA在枯斑三生烟抗性反应中的作用。【方法】N基因的温度敏感性使枯斑三生烟在25℃时具备对TMV的抗性、在31℃抗性丧失,在这两个温度条件下对枯斑三生烟接种TMV和磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline,PBS),48 h后提取系统叶总RNA,构建链特异性文库后进行深度测序。对测序结果进行过滤后利用HTSeq将有效数据与近缘品种TN90(N.tabacum var.TN90)基因组比对,筛选得到lncRNA后利用FPKM法估计lncRNA的表达水平。通过edgeR筛选差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNA,DElncRNA),并利用qRT-PCR技术对这一结果进行验证。通过共定位及共表达分析预测DElncRNA的靶基因,通过参考基因组注释、GO和KEGG富集分析研究靶基因的功能。【结果】4个处理共12个样本经lncRNA-seq各测得约8000万条clean reads,共获得4737条已知lncRNA、40169条新lncRNA。其中64个lncRNA在不同温度条件下TMV侵染后存在差异表达,qRT-PCR测定结果显示这些lncRNA的测序正确率在80%左右,表明本研究所得测序数据具备较高的可信度。对DElncRNA进行靶基因预测,发现一些基因同时被25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶向。靶基因注释功能丰富,主要参与植物抗病、激素和代谢等生理过程。部分可能与激素通路相关的lncRNA,在25℃下TMV侵染时呈现下调趋势,而在31℃下TMV侵染则呈现上调趋势。GO富集分析显示靶基因主要参与构成膜、囊泡等组分,具备钙、钾离子通道抑制剂活性等分子功能,使相应离子得以转运引发随后的反应,同时也参与发病、抗原加工和呈现、细胞分裂素代谢等生理过程。KEGG分析发现靶基因显著富集在植物激素信号转导通路,25℃下调和31℃上调的DElncRNA靶基因同时富集在激素信号传导、ABC运输蛋白、苯丙烷类生物合成等通路。【结论】不同温度(25℃和31℃)条件下TMV侵染枯斑三生烟后,长链非编码RNA差异表达,DElncRNA通过作用于激素信号传导、物质转运等过程参与寄主系统获得性抗性反应。研究结果可为揭示植物系统获得性抗性中lncRNA的调控功能以及新型抗病毒技术开发提供依据。

高效靶向降解烟草花叶病毒核酸的dsRNA筛选与大量制备

【目的】筛选高效靶向降解烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的dsRNA,实现其大量制备,并探究其作用机制。【方法】以TMV编码的CP、MP、RdRP功能基因为靶序列,体外转录合成相应的dsRNA,浸润本氏烟(Nicotiana benthamiana),24 h后接种TMV,于接毒后2、3 d取样提取总RNA和蛋白质,以CP基因mRNA水平和蛋白水平为指标,结合TMV病毒生物学症状,综合评价各dsRNA对TMV的抑制效果。同时结合侵染性克隆TMV-30B在本氏烟烟株上的荧光表达现象和TMV在三生烟(Nicotiana tabacum var. Samsun NN)上的过敏性坏死反应(hypersensitive necrosis reaction),通过比较TMV基因组上6个靶序列相对应的dsRNA,筛选出高效抑制TMV的dsRNA片段。为了获取大量的dsRNA,将dsRNA对应的基因片段插入到原核表达载体L4440的双T7启动子之间,转化至RNase III缺陷型大肠杆菌(Escherichia coli)HT115(DE3)中,并对原核表达制备的dsRNA喷施烟草后生成的siRNA进行深度测序,比较外源施用dsRNA后,对TMV侵染的small RNA表达特征和富集带的影响。【结果】筛选出高效影响TMV CP基因表达的dsRNA RdRP1461-1774,并构建了可诱导形成目的 dsRNA的原核表达载体L4440-dsRdRP1461-1774,可在DE3中大量制备RdRP1461-1774的dsRNA,菌液中提取的dsRNA喷施于烟草上对TMV的防治效果显著。TMV-30B侵染本氏烟时荧光数量减少,并能够延长叶片萎蔫时间,在三生烟上施用时叶片枯斑数量明显减少。小RNA测序结果显示TMV侵染引起的RNAi过程中正义链和反义链以大致相等的频率产生siRNA,而外源性dsRNA的浸润会引起靶向区域siRNA的富集,siRNA反义链累积量骤增,对应的正义链累积量骤减,外源dsRNA的施用能够引起siRNA表达丰度的变化。【结论】通过比较dsRNA介导植物靶向抗TMV侵染的效果来筛选抗烟草花叶病毒的dsRNA序列,最终选定TMV RdRP基因上一段长313 bp的高效作用片段,该片段dsRNA能够高效与靶基因结合,降低染病植株烟草花叶病毒的表达量。同时构建了RdRP1461-1774基因的dsRNA原核表达系统,实现其低成本的高效量产,为后续dsRNA在植物病毒方面的防治应用打下了基础。

20%双草醚悬浮剂防除水稻直播田杂草的药效

为有效控制水稻直播田草害,研究20%双草醚悬浮剂的防除效果、适宜用量和应用安全性.本研究中防除对象为水稻直播田稗草、马唐、莎草、鸭跖草等1年生杂草,以10%双草醚悬浮剂为对照药剂,以清水为空白对照,试验测定4种浓度(有效成分22.5,30.0,37.5,60.0g/hm^2)的20%双草醚悬浮剂的防效,同时跟踪其使用安全性及水稻产量变化.试验结果发现,20%双草醚悬浮剂对目标杂草具有良好的防除效果,优于对照药剂10%双草醚悬浮剂;20%双草醚悬浮剂有效成分60g/hm^2处理的防效显著高于其他3个低浓度处理.对杂草总数量的防效在药后1个月内保持在72%以上,药后45d降至44.91%~62.74%,但对杂草总质量的防效仍达72.33%~89.29%.20%双草醚悬浮剂在水稻直播田具备使用安全性,水稻增产率(与人工除草相比)为-2.70%^-10.81%,所以为水稻直播田理想除草剂,推荐使用剂量为有效成分22.5~37.5g/hm^2.