牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

蜥蜴源黏质沙雷氏菌的分离鉴定与药敏试验

为弄清西北农林科技大学博览园1只观赏蜥蜴突发全身皮肤化脓溃烂、尾巴坏死脱落的病原,采集患病蜥蜴的坏死病灶及血液病料进行细菌分离纯化、生理生化试验、动物致病性试验、16S rRNA基因测序鉴定。结果显示,从病料中分离并纯化出1株菌株,该分离菌株的生理生化特性与黏质沙雷氏菌相符,且该菌对实验小鼠有致病性,其16S rRNA基因序列与NCBI中黏质沙雷氏菌的参考序列同源性为98%。结果表明,所分离到的菌株为黏质沙雷氏菌。药敏试验结果显示,分离菌株对诺氟沙星、丁胺卡那、头孢曲松、氧氟沙星、头孢噻肟等5种抗菌药物高度敏感,对复方新诺明中度敏感,对环丙沙星、头孢噻吩、庆大霉素、头孢氨苄、苯唑西林、多黏菌素B、林可霉素、四环素、氨苄西林等9种抗菌药物耐药。研究结果为筛选有效治疗药物提供了参考依据。

猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。

基于VP6蛋白的牛轮状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立牛轮状病毒(BRV)血清抗体的检测方法,从病料中克隆牛轮状病毒VP6基因,构建其表达载体,利用原核表达技术表达重组VP6蛋白,建立牛轮状病毒血清抗体间接ELISA检测方法。结果显示,重组VP6蛋白大小为40 ku,以包涵体形式表达,Western blot证实重组VP6蛋白有良好的反应原性;以4μg/mL浓度的抗原包被酶标板,一抗血清50倍稀释,酶标二抗稀释10000倍稀释,为最佳工作条件,阴阳临界值为0.233,表明该方法具有良好的特异性和敏感性。建立的检测BRV抗体的间接ELISA可用于临床BRV感染的检测。

牛病毒性腹泻病毒陕西分离株的鉴定及E2基因的克隆与序列分析

为分析陕西省牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分子变异情况,采集陕西省某牛场腹泻患牛粪便样品,经处理后接种至MDBK细胞后,进行病毒分离鉴定并对分离的BVDV进行E2基因的克隆和遗传进化分析。结果显示,样品经过RT-PCR鉴定后接毒,第4天出现明显的细胞病变(CPE),通过设计特异性引物对收获的病毒成功扩增出BVDV E2基因,证明分离的病毒为BVDV。对该病毒的E2基因进行序列分析,所得序列与GenBank上已发表的BVDV毒株的核苷酸序列同源性为84.5%~100%,氨基酸序列同源性为82.1%~100%。结果表明,成功分离到牛病毒性腹泻病毒并进行了E2基因的克隆与序列分析,研究结果可为陕西地区BVDV的流行病学、致病性及生物学特性研究提供依据,为BVDV的区域流行及有效防控提供参考,为新疫苗的研发提供地方种毒。

基于gE蛋白的羊伪狂犬病病毒间接ELISA的建立与应用

为建立羊源伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)抗体的检测方法,从PRV中对gE基因进行克隆,并构建重组载体对gE蛋白进行原核表达,以重组gE蛋白为包被抗原,建立PRV抗体间接ELISA检测方法,并进行临床样本检测。结果显示,重组gE蛋白大小为42 ku,以包涵体形式表达;Western blot检测表明重组蛋白具有良好的反应原性;重组蛋白作为包被抗原的最佳工作浓度为1μg/mL,待检血清100倍稀释,以HRP标记的兔抗山羊IgG 10000倍稀释作为二抗;检测临床样本时判定阴阳性的临界值为0.284;灵敏性试验结果显示,羊PRV阳性血清稀释2048倍时检测结果仍为阳性;批内变异系数(2.45%~5.00%)与批间变异系数(2.55%~7.41%)均小于10%;采用建立的方法检测其他常见羊源病毒阳性血清结果均为阴性;对收集的376份临床羊血清进行检测,PRV阳性率为10.6%。建立的间接ELISA检测方法可用于羊源样本中伪狂犬病病毒抗体的检测,该方法的建立为羊场PRV抗体检测提供了技术支持。

羊贝氏柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)实时荧光定量PCR方法,根据GenBank上收录的C.burnetii RSA439株com1基因序列(CP040059.1)保守区设计特异性引物和探针,并构建重组质粒及优化反应条件,以期建立一种检测贝氏柯克斯体的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,该方法所建立标准曲线线性关系良好;敏感性试验结果显示,最低检出限为2.45×10^(2) copies/μL,与PCR最低检出限为2.45×10^(4) copies/μL相比较,灵敏度提高了100倍;对羊支原体、羊流产衣原体、羊布鲁氏菌等均无交叉反应,批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于3%,说明特异性、重复性好;利用该方法对收集的126份样品进行检测,结果显示样品阳性率为9.52%,常规PCR检测阳性率为7.14%,符合率为90.47%。该方法可为贝氏柯克斯体临床上快速检测及防控提供技术支持。

山羊源贝氏柯克斯体抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立山羊源贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)抗体间接ELISA检测方法,对贝氏柯克斯体的com1基因进行克隆及原核表达,以com1纯化蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法,并对临床收集的血清样本进行检测。结果显示,重组蛋白大小为27 ku,经Western blot鉴定com1蛋白反应原性良好;ELISA检测方法抗原包被量为4μg/mL,血清的稀释倍数为1∶100,酶标二抗稀释倍数为1∶2500,阴阳临界值为0.278。用该方法对流产衣原体、山羊支原体、牛支原体阳性血清进行检测,均为阴性;当C.burnetii阳性血清稀释至2048倍时检测结果仍为阳性;批内、批间变异系数均小于10%。用该方法对陕西省部分羊场收集到的307份血清样本进行检测,样本阳性率为9.12%。成功建立了一种检测贝氏柯克斯体抗体的间接ELISA检测方法,这为C.burnetii引起的Q热的实验室诊断和流行病学调查提供了技术支持。

RNA解螺旋酶DDX5的生物学功能及其在肿瘤中的作用机制研究进展

RNA解螺旋酶DDX5(DEAD-box RNA helicase 5)又称RNA解螺旋酶p68蛋白,是一种广泛存在于真核生物中的重要蛋白质,在调节RNA的生物学过程中发挥着多种重要功能,包括转录、剪接、翻译和RNA稳定性的调节等。随着生命科学的发展和技术的进步,越来越多的研究表明,DDX5在肿瘤中的作用十分重要,不仅可以促进肿瘤的发生和发展,还可以作为潜在的治疗靶点和治疗监测指标。因此,针对DDX5在肿瘤发生发展中的作用机制进行深入研究,对于深入理解肿瘤的发生机制,以及制定有效的抗肿瘤治疗策略具有重要的意义,论文对DDX5的结构特点、生物学功能、在肿瘤中的作用机制及其研究进展进行了综述。

规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染的控制

2022年2月1日,陕西省某规模化母猪场产房仔猪断尾去势液检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸阳性,该批仔猪于2022年2月23日断奶至下游育肥猪场,猪群断奶后3 d出现咳嗽、少食、发热等临床症状,根据临床症状、剖检大体病理变化、兽医实验室检测结果诊断为猪繁殖与呼吸综合征病毒和圆环病毒2型混合感染。为迅速控制猪群病情,对该猪场免疫程序及保健方案进行调整,并对猪群进行为期18周的猪繁殖与呼吸综合征和圆环病毒2型病毒血症期和抗体水平的持续跟踪发现,紧急防控方案实施后2周大群趋于稳定,猪繁殖与呼吸综合征疫苗二免后10周猪群的病毒血症消失,圆环病毒2型疫苗二免后猪群的病毒血症虽未消失,但阳性率有所下降,猪繁殖与呼吸综合征的抗体水平在猪群二免后8周趋于稳定,猪群受圆环病毒2型疫苗毒株及野毒的双重刺激,抗体衰减规律较为复杂,从持续的跟踪检测分析发现圆环病毒2型疫苗二免后6周抗体水平有所下降,8周后抗体水平上升并持续至该批猪出栏。

猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗临床使用效果评估

为评估猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)灭活疫苗的临床使用效果,选用市售A、B两种PRRS灭活疫苗在陕西省某4800头规模化母猪场开展对比试验。试验选取180头健康妊娠母猪,随机分为3组,在猪场正常生产管理流程下分别在母猪妊娠8周龄免疫A PRRS灭活疫苗、B PRRS灭活疫苗和灭菌生理盐水(对照组)。通过对试验组和对照组生产成绩、疫苗免疫后的抗体水平变化、分娩仔猪14日龄的PRRS母源抗体水平及仔猪PRRS水平传播能力等综合分析,发现A PRRS灭活疫苗免疫组生产成绩优于B PRRS灭活疫苗免疫组和对照组;A PRRS灭活疫苗免疫组母猪及14日龄仔猪抗体水平均高于B PRRS灭活疫苗免疫组和对照组;A PRRS灭活疫苗免疫组仔猪PRRS的水平传播能力低于B PRRS灭活疫苗免疫组和对照组。说明妊娠8周母猪免疫A PRRS灭活疫苗可提高母源抗体对仔猪的保护力,A PRRS灭活疫苗在一定程度上可阻断PRRS在产房的水平传播。

致牛腹泻4种细菌多重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

随着规模化和集约化养牛业的不断发展,多种致病菌混合感染造成牛腹泻严重制约了养牛业的快速发展,对腹泻病原进行快速准确鉴别诊断对疫病防控至关重要。根据沙门氏菌的ivnA基因、大肠埃希氏菌的23S rRNA基因、产气荚膜梭菌的plc基因以及志贺氏菌的ipaH基因的保守区域建立了可同时检测这4种细菌的多重荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性和重复性进行了研究。结果显示,建立的标准曲线线性关系良好;优化后的检测方法仅可特异性扩增出4种目标细菌;对大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌和产气荚膜梭菌的最低检出限分别为9.4×10~1copies/μL、1.2×10~2copies/μL、9.1×10~1copies/μL和1.4×10~3copies/μL,该方法的灵敏性高于普通单项PCR检测方法10倍;批内、批间差异均小于5%。用此方法检测人工感染病料,每份病料均检测出对应攻毒细菌的荧光信号。以上结果表明,所建立的多重荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于致牛腹泻细菌的实验室检测。

猪繁殖与呼吸综合征两种减毒活疫苗免疫后病毒载量及抗体水平分析

为了解A、B两种商用猪繁殖与呼吸综合征减毒活疫苗免疫猪后病毒血症及抗体水平的差异,在后备母猪场随机选择100头35日龄后备母猪,分为A、B两组,分组后猪混养14 d。试验猪50日龄时,对A组50头后备母猪免疫A疫苗(1头份/头),B组50头后备母猪免疫B疫苗(1头份/头),疫苗免疫后0、1、2、3、5、7、10、14、21、28、35 d各组猪随机采集血样10份,荧光定量PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒载量,ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体。结果显示,B疫苗免疫后,试验猪的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒血症期持续时间更久,持续至免疫后35 d;A疫苗免疫后,试验猪的猪繁殖与呼吸综合征病毒载量更高;B疫苗免疫后试验猪的N蛋白抗体水平变化趋势更稳定;B疫苗免疫后试验猪的PRRSV GP蛋白抗体水平更高。试验结果表明B疫苗的免疫效果优于A疫苗。

猪流行性腹泻病毒抑制干扰素λ的病毒蛋白筛选及验证

旨在验证猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株在非洲绿猴胚胎肾细胞(MARC-145)上是否具有抑制宿主Ⅲ型干扰素λ(IFN-λ)的能力,筛选并鉴定介导抑制宿主IFN-λ的病毒蛋白。通过预测猪IFN-λ1和IFN-λ3启动子序列,以提取的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)基因组DNA为模板,扩增启动子序列,构建启动子荧光素酶报告基因质粒pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc,使用双荧光素酶报告基因、实时荧光定量PCR两种方法分别检测病毒感染、病毒蛋白表达对IFN-λ1和IFN-λ3启动子活性和转录本水平的调控。结果显示:成功构建了启动子荧光素酶报告质粒pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc,证实了PEDV AH2012/12变异株在MARC-145上能够抑制宿主IFN-λ产生,且非结构蛋白(NSP)1、5、9和开放阅读框(ORF)3下调IFN-λ1,NSP1、NSP5、NSP8和ORF3下调IFN-λ3,其中NSP5的下调作用最为明显。研究结果为PEDV逃逸IFN-λ提供了理论依据,丰富了PEDV调控先天性免疫的分子机制。

基于0507蛋白的山羊支原体山羊肺炎亚种抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)抗体检测方法,对Mccp的0507基因进行克隆与载体构建,通过原核表达技术制备重组0507蛋白,建立Mccp抗体间接ELISA检测方法,验证该方法的特异性、灵敏性与重复性,并对临床收集的血清样品进行检测。结果显示,重组0507蛋白大小为39 ku,Western blot证明重组0507蛋白具有良好的反应原性;建立的ELISA检测方法抗原包被量为3μg/mL,血清稀释倍数为1∶200,酶标二抗稀释倍数为1∶2500,阴阳临界值为0.221。用该方法对山羊流产衣原体、立克次氏体与牛支原体的阳性血清进行检测,结果均为阴性;Mccp阳性血清最大稀释倍数为1024倍;批内、批间变异系数均小于10%。对陕西省部分羊场收集到的282份血清进行检测,Mccp阳性率为13.1%。该研究建立了一种检测Mccp抗体间接ELISA检测方法,为Mccp的实验室诊断和流行病学调查提供了技术支持。

猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及抗E2蛋白单克隆抗体的制备

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经克隆和筛选获得了4株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗可与CSFV产生特异性反应并具有中和活性。

PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白在杆状病毒囊膜表面的共展示及展示蛋白的免疫原性分析

本试验旨在构建以杆状病毒表面展示系统为基础的猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟双价基因工程亚单位疫苗候选株。利用杆状病毒表面展示技术构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白和猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的重组杆状病毒BacSC-Dual-ORF5-E2。该重组病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM。对重组病毒进行Western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验以及淋巴细胞增殖试验。Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组GP5和E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf-9后在细胞膜上展示了重组GP5和E2蛋白;免疫金电子显微镜观察表明,重组GP5和E2蛋白展示在杆状病毒囊膜上;动物免疫试验表明,重组杆状病毒免疫小鼠后产生了抗PRRSV和抗CSFV的特异性抗体;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒能诱发较强的细胞免疫应答。本试验成功构建表面展示PRRSV GP5蛋白和CSFV E2蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用该重组杆状病毒作为双价亚单位疫苗预防PRRSV和CSFV的混合感染奠定基础。

观赏金鱼豚鼠气单胞菌的分离鉴定及防治

从陕西省某观赏鱼养殖场发生出血病的金鱼中分离到一株细菌,通过培养特性、菌体形态、菌落特征、染色特性、生化试验等一系列的系统鉴定,确定为豚鼠气单胞菌。动物致病性试验表明,该菌对小白鼠和金鱼有较强的致病性,可引起其死亡。药敏试验证明该菌对四环素、庆大霉素、氯霉素等高度敏感,对氟哌酸、链霉素等中度敏感,对红霉素、青霉素等不敏感。通过药敏试验选用有效抗生素,有效地控制了该病的流行。

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的构建及动物免疫试验

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。PCR克隆除去信号肽序列的PRRSV ORF5基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-ORF5。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失Asd、Cya、Crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF5)。鉴定重组菌GP5蛋白的表达;测定重组菌定居特性及安全性;检测免疫小鼠血清抗体;流式细胞仪检测重组菌对小鼠T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群的影响;最后进行免疫猪血清抗体检测。结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;Western blot证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合;重组菌在体内可较稳定地定居于小鼠的肠系膜淋巴结和脾脏中,并在其中表达出GP5蛋白;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;重组菌口服免疫小鼠可以产生抗GP5蛋白抗体且抗体具有中和活性;重组菌株能不同程度地使CD4+、CD4+/CD8+升高,而使CD8+下降,表明重组菌对细胞免疫功能具有调节作用;淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱发小鼠产生较强的细胞免疫应答;重组菌口服免疫猪可以产生抗GP5蛋白抗体。本试验成功构建了能稳定表达PRRSV GP5蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究PRRSV口服基因工程疫苗奠定基础。

传染性法氏囊病病毒超强毒株致弱的分子生物学特征

为了探索传染性法氏囊病病毒 ( IBDV)超强毒株致弱的分子特征变化 ,采用 RT-PCR技术 ,从超强毒 ( vv IBDV)及其不同代次细胞传代致弱毒中扩增到编码 VP2蛋白的 c DNA高变区基因 ,并对其序列测定。将 vv IBDV及其致弱毒株 VP2高变区的氨基酸与其它血清 I型毒株比较 ,发现 vv IBDV与其致弱毒株在VP2高变区的 2 2 2、2 4 2、2 53、2 56、2 71、2 79、2 84、2 94、2 99和 3 0 0位氨基酸发生了改变 ,而这些氨基酸的变化使亲水区和七肽区发生了改变 。