猪非典型瘟病毒的基因组特征分析及荧光定量RT-PCR检测方法的建立

最近的研究表明,猪非典型瘟病毒(APPV)在我国猪群流行,并造成了严重的危害。本研究应用RT-PCR方法对APPV GD3株进行了全基因组扩增、测序,并进行了全基因组及其部分编码基因的遗传演化分析;根据APPV基因组编码的结构蛋白E2的基因序列,构建了APPV的荧光定量RT-PCR检测方法。APPV GD3株的全基因组序列与德国、美国、荷兰和西班牙毒株在不同的进化分支上,同源性为83.1%~83.4%;与中国毒株GD1、GD2和GD的同源性分别为99.5%、99.6%和83.4%。GD3株编码的E2、Npro和Erns基因与国内外现有毒株的同源性分别为83.1%~99.7%、80.2%~99.8%和81.9%~99.5%。本研究建立的荧光定量RTPCR检测方法特异性强、最低检测浓度为10 copes/L、操作简单、耗时短,具有良好的兽医临床应用前景。

家禽病例中马链球菌兽疫亚种的分离鉴定及致病性观察

为研究马链球菌兽疫亚种对家禽的致病性,采集流行地区发病鸡和鸽的肺脏,分离了8株链球菌,并利用染色镜检、生化试验和PCR方法进行鉴定,结果为3株属马链球菌兽疫亚种,5株属粪肠球菌。在此基础上,选择1株马链球菌兽疫亚种内蒙分离株,经腹腔注射途径人工感染SPF(Specific pathogen free chicken)鸡和肉鸡,攻毒后死亡率分别为40%和80%。剖检观察到出血性肺炎、气囊炎和心包炎,尤其是肉鸡出现60%的支气管栓塞病变,这与临床病理学变化相似。此外,采用微量肉汤测定法测定8个临床分离菌株测定对15种药物的最小抑菌浓度(Minimum inhibition concentration,MIC),结果显示10株链球菌对于氟苯尼考、莫西沙星、甲磺酸加替沙星、乳酸环丙沙星及强力霉素高度敏感,MIC值均小于7.813μg/mL。分离株对于泰乐菌素、磷霉素钠、螺旋霉素和阿莫西林高度耐药,MIC值大于250μg/mL。试验提示马链球菌兽疫亚种可能是家禽气囊炎一个重要的病原之一,临床防治中应使用敏感性高的抗菌素。

海南黑山羊IFITM3基因组织特异性表达和分布的研究

干扰素诱导跨膜蛋白3(interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)在机体抗病毒和抗炎等方面发挥重要作用。为深入研究山羊IFITM3在病毒感染中的分子作用机制,对获得的海南黑山羊IFITM3基因进行了序列分析并采用RT-qPCR方法进行了其组织特异性表达的检测,利用原核表达的IFITM3蛋白制备了多克隆抗体,并进行IFITM3在黑山羊组织中分布的研究。结果显示,该基因表现出种属内保守性和种属间差异性,编码蛋白由147个氨基酸组成,存在2个潜在跨膜区,不含信号肽。成功构建pET-32a(+)-IFITM3表达载体并表达了35 ku重组蛋白,免疫家兔后,经ELISA和Western-blot检测,获得的多克隆抗体特异性好。组织特异性表达的检测结果表明,IFITM3在心脏表达水平最高,大脑和胸腺表达量最低。IFITM3在心肌细胞、肝细胞、脾网状内皮细胞、肺支气管上皮细胞、肾小管上皮细胞、大脑皮质、胸腺髓质、肠系膜淋巴结皮质淋巴细胞、胃底腺细胞和肠腺细胞中均有分布。研究结果为深入探讨IFITM3在山羊疾病中的分子作用机制提供了基础数据。

山羊STING的克隆及其在OFTu细胞的表达

为了解山羊干扰素刺激基因（stimulator of interferon genes，STING）及其编码蛋白的生物学信息，本试验采用RT-PCR法克隆了海南黑山羊STING基因并进行序列及其编码蛋白的分析，构建了pEGFP—N1-STING袁达载体并转染至OFTu细胞进行了表达。结果表明STING基因的物种内同源性高、种间同源性低，编码蛋白由378个氨基酸组成，存在4个潜在跨膜区，含有1个信号肽；转染和Western blot试验证实，构建的表达载体可在OFTu细胞中成功表达。本试验为构建STING专性表达细胞系及深入研究其在山羊抗感染免疫的机制奠定了基础。

基于猪非典型瘟病毒E2蛋白的间接ELISA检测方法的建立

猪非典型瘟病(APPV)是新近发现能引起仔猪先天震颤的病原体,血清学检测方法亟待构建。本研究制备了APPV原核表达的E2重组蛋白,以其作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法。结果表明,最佳抗原包被浓度为10μg/mL,最佳血清稀释度为1:40,阴阳性临界值D450=0.243,灵敏度达到1:64;与猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪流感及圆环病毒病的阳性血清均不发生交叉反应,特异性好;批内变异系数最大值为3.797%,批间变异系数最大值为5.425%,重复性好。利用建立的间接ELISA方法对50份猪临床血清样本进行检测,阳性率为12%。本研究基于E2蛋白建立的间接ELISA方法为猪非典型瘟病毒感染的检测提供了可靠的工具,也为开展APPV相关的研究工作提供了基础材料。

BALB/c小鼠SLIT2和ROBO4基因组织特异性表达与分布的研究

SLIT2/RO BO4信号通路在炎症血管反应、白细胞渗出和血管再生等方面发挥重要作用。为深入了解SLIT2/ROBO4信号转导途径在炎症性疾病发生发展过程中的作用机制,本研究采用RT-q PCR和免疫组织化学的方法对SLIT2和ROBO4基因在BALB/c小鼠组织特异性的表达和分布进行了研究。结果表明：SLIT2在肾脏、心脏、肺脏和大脑中表达相对较高,在肾脏表达量最高;ROBO4在心脏、肝脏、肺脏和肾脏中表达相对较高,在心脏中表达量最高。免疫组织化学检测表明,SLIT2和ROBO4在心肌细胞、肝细胞、脾脏的内皮细胞、肺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞和大脑皮质神经元中表现出相似的阳性定位。研究结果为深入探讨SLIT2/ROBO4信号通路在炎症性疾病发生发展和调控中的分子作用机制提供了基础数据,也为发展基于该通路的器官特异性炎症治疗策略提供了科学依据。