重构型Caspase-6对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的 将人Caspase 6基因大小亚基顺序颠倒 ,表达为重构型Caspase 6分子 ,探讨其对细胞凋亡的促进作用。方法 RT PCR获取人Caspase 6基因 ,测序判断正确后 ,通过重组PCR的方法构建大小亚基顺序颠倒的重构型Cas pase 6 (RevCasp6 )基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白 (GFP)基因的真核表达载体 pIRES2 EGFP中 ,转染人宫颈癌细胞系HeLa ,在荧光显微镜下观察细胞形态的变化 ,用电子显微镜进一步观察细胞的凋亡特征。结果 获得了人Caspase 6基因 ,并成功地构建了大小亚基顺序颠倒的RevCasp6基因。以构建的RevCasp6真核表达载体 ,转染HeLa细胞后 ,荧光显微镜观察到细胞生长不良、细胞核结构破坏和细胞死亡。电子显微镜观察显示 ,转染了RevCasp6基因的细胞呈凋亡的典型特征。

人重构型caspase-6基因在Hela细胞中的诱导表达

目的 :将重构型caspase 6分子 (RCasp 6 )克隆入可诱导真核表达载体 pIND中 ,经蜕皮激素类似物诱导探讨其对细胞凋亡的促进作用。方法 :用PCR扩增RCasp 6基因 ,并克隆入真核表达载体pIND中。以重组体转染Hela细胞系 ,蜕皮激素类似物诱导。RCasp 6基因的表达产物采用免疫细胞化学染色检测。HE染色观察转染细胞的形态变化 ,并计数细胞绘制生存曲线。结果 :成功地构建了RCasp 6基因的可诱导真核表达载体。转染的细胞经蜕皮激素诱导后 ,细胞形态异常。转染了RCasp 6基因的细胞固缩同时很多细胞死亡。 结论 :RCasp 6基因具有促进细胞死亡的作用。

人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中的表达

目的 :观察人重构型caspase 6基因在Hep 2细胞中的表达及其对转染的Hep 2细胞的作用 .方法 :用RT PCR方法获取人caspase 6全长cDNA ,经重组PCR构建大小亚基次序颠倒的重构型caspase 6 (re caspase 6 ,简称rcasp6 ) .将所获重组基因克隆入真核表达载体pCMV ,转染Hep 2细胞 .用间接免疫荧光法及免疫细胞化学染色检测目的蛋白表达 ,HE染色和电镜观察转染细胞的形态和结构的变化 ,细胞计数检测转染目的基因后细胞生长状况的变化 .结果 :成功地获得了人重构型caspase 6基因 (rcasp6 ) ,并构建了真核表达载体 .转染Hep 2细胞后 ,检测到目的蛋白的表达 .倒置显微镜观察转染细胞有明显变化 ,培养情况下出现大量细胞固缩变小 ,伴随有细胞死亡 .HE染色和电镜观察显示 ,固缩的细胞呈现凋亡的典型特征 .结论 :人重构型caspase 6基因在Hep 2细胞中表达 ,可使转染细胞的形态发生变化 。

三种阳离子脂质体转染效率的测定

目的 测定研制的３种阳离子脂质体（Ａ，Ｂ，Ｃ）的转染效率，并且与ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ的转染效率进行比较。方法 采用分子克隆的方法。将ｌｕｅ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３载体。以质粒ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｃ与一定量的阳离子脂质体及ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染食管癌Ｅａ１０９细胞，一定时间后测定荧光强度以确定ｌｕｃ的表达量。结果 成功地构字质粒ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｅ，转染后，。发现阳离子脂质体Ａ的转染效率较高。

NT3基因工程细胞经脑脊液途径的耳蜗内生物学效应的初步证明

目的 通过脑脊液途径移植神经营养因子 - 3(NT3)基因工程细胞 ,初步观察其耳蜗内听觉生物学效应。方法 将体外构建的NT3基因工程细胞扩大培养 ,收集浓缩培养上清中的蛋白 ,用印迹杂交鉴定其分泌蛋白的生物学效应 ,再将适当的细胞直接移植到 2 0天龄近交BALB/C小鼠的脑脊液中 ,4 0天后比较移植前后的畸变产物耳声发射 (DPOAE)幅值。结果 体外构建NT3基因工程细胞是可行的 ,其具备分泌NT3的功能 ,经脑脊液途径注射后观察到BALB/C小鼠耳蜗功能的老化在高频范围内得到了延缓 ,DPOAE高频范围幅值下降减缓。结论 NT3基因工程细胞具有较好的体外体内生物学效应 ,可以用于进一步实验治疗感音性聋的研究 ;

Caspase-3融合蛋白基因的构建及其对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的 观察重构型 caspase- 3及其 N-端融合蛋白的表达对 He L a细胞的凋亡诱导作用 .方法 用反转录 PCR获取人 caspase- 3基因 ,用重组 PCR方法构建人重构型 caspase-3及其融合蛋白基因 ,将基因克隆入表达载体 pc DNA3,脂质体法转染 He L a细胞 ,通过细胞计数、电镜观察、MTT法等检测被转染细胞的生长及其凋亡状况 .结果 成功获得了 cas-pase- 3基因 ,构建了重构型 caspase- 3基因和重构型 caspase- 3与绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因及其表达载体 ,与对照组相比 ,在转染后 1～ 4d内 ,两种基因的表达均导致 He L a细胞存活数减少 ,大量细胞发生凋亡 ,且二者活性相当 .结论 重构型 caspase- 3及其融合蛋白可以诱导转染的 He L

bcl-2核酶与Bax在诱导食管癌细胞凋亡中的协同作用

为了同时调节二种凋亡相关蛋白的表达诱导肿瘤细胞凋亡 ,探索肿瘤基因治疗的可能性 ,同时转入可诱导表达的特异性切割 bcl- 2的核酶基因及 bax基因 ,间接免疫荧光标记法检测 Bcl- 2及Bax蛋白的表达量 ,用 TUNEL、流式细胞术及琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 .共转染后 Bcl- 2蛋白表达下降 ,同时 Bax蛋白表达升高 ,导致 30 %左右细胞凋亡 ,并可使细胞对紫杉醇的敏感度增加近4倍 ,使紫杉醇有效作用时间缩短近一倍 .同时调节二个凋亡相关基因可导致细胞凋亡 ,并能有效促进化疗药物诱导的凋亡 .同时校正多个基因的异常表达 ,比仅仅改变单个基因可更有效地达到治疗肿瘤的目的 .

截短型人Bid融合蛋白对HeLa细胞的促凋亡作用

目的 :观察截短型人bid及其N端融合蛋白的表达对HeLa细胞的促凋亡作用 .方法 :通过反转录PCR方法获取人全长bid基因 ,再经PCR方法克隆得到截短型bid(trun catedbid ,tbid)基因及其N端融合蛋白基因插入pcDNA3真核表达载体 ,脂质体法转染HeLa细胞 ,通过间接免疫荧光 ,电子显微镜以及流式细胞仪等方法观察被转染细胞的生长及凋亡状况 .结果 :成功获得人bid基因 ,构建了tbid基因及tbid与绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因的真核表达载体 (pcDNA3 tbid6 1 ,pcDNA3 PE tbid6 1 ) .与对照组相比 ,在转染后 1 2～ 4 8h内两种基因的表达均导致HeLa细胞发生凋亡 ,且两者活性相当 .结论

GFP共表达检测重组型Caspase-3对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的探讨由野生型人caspase-3大小亚基颠倒构建的重组型caspase-3的促细胞凋亡活性。方法用RT-PCR法获得人caspase-3基因。通过重组PCR进行改造,构建小亚基位于大亚基之前的两种重组型caspase-3基因,它们所对应的蛋白质的N端,分别带有或没有其自身识别的四肽序列。将上述基因克隆入绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pIRES2-EGFP中,转染人HeLa细胞,在荧光显微镜和电镜下观察转染细胞的形态和结构。结果成功地获得了野生型caspase-3基因及两种重组型caspase-3基因。构建了重组型caspase-3基因的表达载体。转染HeLa细胞后,重组型caspase-3基因在细胞中得到表达,随后引起细胞荧光强度下降,生长状况变差甚至死亡。电镜观察显示,许多细胞呈现凋亡的典型特征。结论重组型caspase-3可促进HeLa细胞的凋亡。

截短型人bid基因的克隆、表达和促凋亡作用的研究

目的 :探讨截短型bid(truncatedbid ,tbid)基因的表达对Hela细胞的促进凋亡活性。方法 :用RT PCR法克隆人全长bid基因 ,测序正确后 ,通过PCR截去编码N末端 6 0个氨基酸残基的基因 ,而获得tbid基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,用脂质体法转染Hela细胞。通过荧光显微镜、电子显微镜观察和TUNEL检测法 ,检测目的基因的表达对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果 :成功地构建了tbid基因的真核表达载体。以其转染Hela细胞后 ,tbid基因在细胞中得到表达 ,随后引起细胞荧光强度下降 ,生长状况不良甚至死亡。电镜观察及TUNEL检测的结果显示 ,许多细胞呈典型的凋亡特征。结论

人颗粒酶B融合蛋白对转染的HeLa细胞的作用

目的 观察颗粒酶Ｂ（ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ）融合蛋白对转染的ＨｅＬａ细胞的作用。 方法用ＲＴ－ＰＣＲ法获取人ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ全长ｃＤＮＡ，经重组ＰＣＲ将活性型序列的５′端与一段 ＰＥ转膜肽序列融合。将所获重组基因克隆入绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）共表达载体ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ，转染ＨｅＬａ细胞。用免疫组化染色法检测目的蛋白的表达，荧光显微镜和电镜观察转染细胞的形态和结构。 结果成功地获得了野生型ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｃＤＮＡ及其融合蛋白基因，并构建了融合蛋白基因与ＧＦＰ基因共表达的真核载体。转染ＨｅＬａ细胞后，检测到目的蛋白的表达。荧光显微镜观察转染细胞有两种变化：一种表现为体积增大并常伴随多核现象；另一种出现细胞质和细胞核的固缩。电镜观察显示，多核巨细胞生长状态良好，固缩的小细胞则呈现凋亡的典型特征。结论ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ融合蛋白在ＨｅＬａ细胞中异位表达，可使转染细胞的形态发生变化，出现多核的大细胞和核固缩的小细胞。

抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建抗人HBsAg单链抗体基因 ,并分析其在COS 7细胞中的表达。方法 :以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板 ,分别扩增其轻、重链可变区 (VL、VH)基因 ,通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(Gly4Ser) 3的编码序列连接 ,并引入前导肽编码序列 ,构建具有L VH Linker VL 结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白 (GFP)融合表达载体pEGFP N3,并转染COS 7细胞进行表达。结果 :经测序表明 ,前导肽、连接肽、VL 及VH 的序列正确。酶切鉴定证实 ,成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS 7细胞后 ,通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后 ,进行SDS PAGE及Westernblot分析 ,可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实 ,所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论 :成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因 ,并可在COS

重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响

目的 克隆人ｃａｓｐａｓｅ－８催化结构域基因片段，并将其改建成２种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因，转染ＨｅＬａ细胞，观察重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因的表达及其对ＨｅＬａ细胞生长的影响。 方法 用ＲＴ－ＰＣＲ法，克隆人ｃａｓｐａｓｅ－８催化结构域基因片段，经重组ＰＣＲ改造，构建大、小亚基基因次序颠倒的重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因。将其克隆入绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）真核表达载体ｐＩＲＥＳ２－ＥＧＦＰ，转染ＨｅＬａ细胞，用荧光显微镜和倒置显微镜镜观察细胞的形态和结构。 结果用ＲＴ－ＰＣＲ法，成功地克隆了人ｃａｓｐａｓｅ－８催化结构域基因片段，构建了３种重构型人 ｃａｓｐａｓｅ－８基因及其真核表达载体。转染ＨｅＬａ细胞后，重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因的表达可导致ＨｅＬａ细胞死亡。 结论重构型人ｃａｓｐａｓｅ－８基因在ＨｅＬａ细胞中的表达可以有效地引起ＨｅＬａ细胞死亡。

人granzyme B基因在HeLa细胞中的表达

目的 构建携带人 granzym e B基因的真核表达载体 ,并将其在 He L a细胞中表达 .方法 用反转录 PCR获取人 granzyme B全长 c DNA序列 ,将其活性型序列克隆进 pc D-NA3重组表达质粒 .脂质体法转染 He L a细胞 ,间接免疫荧光检测目的蛋白表达 ,HE染色观察其对转染 He L a细胞形态的影响 .结果 成功获得了野生型 granzym e B c DNA,构建了编码活性型 granzyme B的真核表达载体 pc DNA3- G.转染He L a细胞后观察到目的蛋白表达 ,转染细胞形态发生变化 ,出现多核大细胞及固缩小细胞 .结论 活性型 granzyme B哺乳动物表达系统的建立 ,为进一步研究 granzym e

重构型人caspase-8基因的表达诱导HeLa细胞凋亡

以两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase 8基因的pIRES2 EGFP真核表达载体转染HeLa细胞 ,用间接免疫荧光染色、免疫细胞化学染色和电镜观察等方法 ,研究重构型人caspase 8基因在HeLa细胞中的表达及其促凋亡活性 .结果显示 ,两种重构型人caspase

人NT3、BDNF基因Tet-on可调控重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 NT3和pTRE Shuttle2 BDNF。用PI SceI和I CeuI双酶切后将所获NT3及BDNF基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno X连接 ,构建成pAdeno NT3及pAdeno BDNF的重组腺病毒载体。以电穿孔转化E .coli后挑取克隆进行PCR及酶切鉴定。结果 :重组腺病毒载体的PCR鉴定表明 ,在 312bp处出现特定的条带 ;酶切鉴定证实 ,得到约 2 3kb的预期片段 ,说明人NT3、BDNF基因与腺病毒载体pAdeno X已正确连接。结论 :成功地构建了含人NT3和BDNF基因的四环素可诱导重组腺病毒载体 。

抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（ｍＡｂ）κ链基因，并将其转染到ＨｅＬａ细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白ｍＡｂ的杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中提取总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ法获取κ链ｃＤＮＡ。将其克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，用脂质体转染法转染ＨｅＬａ细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠ｍＡｂ杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中克隆了κ链基因。序列测定表明，Ｖκ属于鼠免疫球蛋白ⅩⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－Ｅ４Ｂ７κ转染ＨｅＬａ细胞后，在ＨｅＬａ细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在ＨｅＬａ细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Ｆａｂ段打下了良好基础。

抗人精浆蛋白单抗重链Fd段基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白 m Ab重链 Fd段基因 ,并将其转染到 He L a细胞进行表达 .方法 从分泌抗人精浆蛋白 m Ab的杂交瘤细胞系 E4 B7中提取总 RNA,用 RT- PCR法获取重链 Fd段 c DNA.将其克隆入真核表达载体 pc D-NA3,用脂质体转染法转染 He L a细胞 ,并用免疫荧光染色方法检测重链 Fd段的表达 .结果 从分泌抗人精浆蛋白的鼠m Ab杂交瘤细胞系 E4 B7中克隆出了重链 Fd段基因 ,序列测定表明 ,VH 与鼠免疫球蛋白 MUSIGHAEI同源性最高 .将含重链 Fd段基因的真核表达载体 pc DNA3- E4 B7Fd中转染He L a细胞后 ,在 He L a细胞中检测到了重链 Fd段的表达 .结论 获得了序列正确的重链 Fd段基因 ,它在 He L a细胞中可以成功地表达 ,为进一步构建和表达 Fab奠定基础 .

重组人肿瘤坏死因子-α联合肿瘤坏死因子受体1基因转染杀伤舌癌细胞的实验研究

目的 :观察重组人肿瘤坏死因子 α(rhTNF α)对建系细胞 (T T)作用效应与机制。方法 :反转录PCR方法克隆人TNFR1基因 ,并将其稳定转染入舌癌细胞中 ,建系并鉴定 ;通过MTT法检测、DNA降解片段琼脂糖凝胶电泳及电镜观察检测rhTNF α对T T细胞的作用效果与机制。结果 :成功构建含TNFR1基因的真核表达质粒 pcDNA3 TNFR1,并建立表达TNFR1蛋白活性的舌癌细胞系T T ;较之亲本Tca 8113细胞及转染空载体的T pc细胞 ,rhTNF α对T T细胞具有更强的细胞毒作用 ,且通过介导细胞凋亡的方式发挥其作用。结论 :重组人肿瘤坏死因子 α联合肿瘤坏死因子受体 1基因转染可有效地杀伤舌癌细胞 ,为舌癌基因治疗提供理论依据。

survivin基因的RNA干涉抑制人乳腺癌SKBr-3细胞体外增殖的作用

目的:研究RNA干涉(RNAinterference,RNAi)抑制survivin基因表达后对人乳腺癌SKBr3细胞体外增殖能力的影响。方法:通过RTPCR和间接免疫荧光检测转染survivin靶向的小干涉RNA表达载体pSUPERS1后SKBr3细胞中survivin基因的表达;集落形成实验、MTT比色法检测细胞体外增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期。结果:转染pSUPERS1后,SKBr3细胞中survivin的mRNA和蛋白表达水平明显降低;克隆形成率(38±16.70)%比对照组(90.3±4.04)%显著降低;细胞增殖减慢,主要阻滞于G1期(74.03±8.91)%。结论:RNA干涉沉寂survivin基因表达后明显抑制了人乳腺癌SKBr3细胞的体外增殖能力。