Fc-沉默型抗人CD36嵌合抗体的制备及作用初步鉴定

目的制备Fc-沉默型抗人CD36嵌合抗体,分析其生物活性及对CD36(+)血小板的吞噬影响。方法通过杂交瘤细胞株RNA提取、PCR扩增及序列分析获得单克隆抗体(mAb)32-106的V H和V L基因序列;利用基因合成和重组技术构建抗人CD36嵌合抗体轻、重链的表达载体;经Zeocin及杀稻瘟菌素筛选,获得稳定表达嵌合抗体的细胞株;利用亲和层析柱纯化抗体;SDS-PAGE检测嵌合抗体纯度及分子量;ELISA及流式细胞术测定抗体结合CD36抗原的活性;通过血小板吞噬实验分析嵌合抗体参与CD36(+)血小板吞噬的能力。结果成功构建嵌合抗体轻、重链表达载体;共转染HEK293细胞后,经筛选及克隆化获得稳定表达嵌合抗体的细胞株;蛋白银染证实嵌合抗体的纯度高及分子量正确;流式细胞术及ELISA结果表明嵌合抗体具有结合人CD36抗原的活性;血小板吞噬实验表明Fc-沉默型抗人CD36嵌合抗体基本丧失介导单核细胞吞噬CD36(+)血小板的能力。结论本研究成功制备了Fc-沉默型抗人CD36嵌合抗体,并在体外证实其丧失介导CD36(+)血小板清除的能力,为修饰抗体用于CD36抗体介导的胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症(FNAIT)治疗研究奠定了理论基础。

因HLA和CD36复合抗体致血小板输注无效患者的配型策略

目的为HLA和CD36复合抗体所致血小板输注无效(PTR)患者寻求相合或相容的供者血小板输注。方法采用ELISA方法检测PTR患者的血小板抗体及HLA⁃Ⅰ类抗体特异性;运用MATCH IT!和HLA Matchmaker软件,分析患者HLA⁃Ⅰ类抗体特异性及相应抗原决定簇(epitopes);采用HLA⁃SSO分型技术,获得供、患者的HLA基因型;根据HLA⁃I类抗原交叉反应组(CREG)或HLA表位配型(Eplet)策略,寻找与PTR患者相合或相容的供者血小板;通过血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定检测技术(MAIPA)和血小板免疫荧光流式检测(PIFT)鉴定匹配程度;最后,通过血小板计数纠正增加指数(CCI)评估血小板输注效果。结果2名PTR患者体内检测到针对HLA⁃Ⅰ类和CD36的复合抗体,且CD36流式表型为Ⅰ型缺失;抗体特异性检测结果显示,患者1和患者2的血清中存在高频的HLA⁃Ⅰ类抗体,PRA分别为56%(54/96)和53%(51/96);运用HLA的CREG和Eplet配型策略,在CD36缺失供者库分别筛选到与患者1匹配等级C的供者1名,与患者2匹配等级D的供者1名,且选择的供者均规避患者HLA⁃Ⅰ类抗体表位所针对的抗原;MAIPA和PIFT结果亦证实患者与供者血小板无免疫反应,且患者2输注相容血小板24 h CCI>4.5。结论针对HLA和CD36复合抗体所致PTR患者,可联合运用血清学交叉配型、HLA⁃CREG及Eplet配型策略,选择CD36缺失,规避HLA⁃Ⅰ类抗体对应抗原且HLA表位匹配的供者血小板。

人类白细胞抗原抗体引起输血相关急性肺损伤发病原因分析

2019年9月至2020年10月广州血液中心对临床诊断为人类白细胞抗体引起输血相关急性肺损伤(TRALI)的3例患者进行发病原因分析,包括男2例,女1例,年龄分别为56、50及20岁。通过固相凝集法、抗人球蛋白试验及流式细胞术检测供者体内是否存在针对患者的抗体;采用基于测序的人类白细胞抗原(HLA-SBT)分型技术检测患者的人类白细胞抗原(HLA)基因型;采用Lifecodes HLA-Ⅰ/Ⅱ类单抗原特异性抗体检测试剂(LSA-Ⅰ/Ⅱ),通过Luminex 200液相悬浮芯片系统检测供者血液中的HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗体特异性;并分析供者体内针对患者HLA的特异性抗体及相应抗原决定簇。结果显示,供者体内检出针对TRALI患者的HLA-Ⅰ或Ⅱ类特异性抗体,其中患者1接受的供者3血浆中含有针对患者HLA-DRB1^(*)09∶01抗原的抗体,介导供受者抗原抗体反应的抗原决定簇为70R、31I、70QA;供者4血浆中存在针对患者2的HLA-A^(*)11∶02、HLA-A^(*)11∶01、DRB1^(*)12∶02及DRB1^(*)09∶01抗原的抗体,相关抗原决定簇为151AHA、57V和16Y;供者6和供者7血浆中存在针对患者3的HLA-DRB1^(*)14∶04、DRB1^(*)11∶01及DPB1^(*)05∶01抗原的抗体,相关抗原决定簇为96HK、140TV、13SE及111K。通过实验室检测分析明确了3例TRALI病例是由HLA抗体引起的,对临床疑似TRALI病例应重视HLA抗体检测,并给予针对性的诊断及治疗。

广州地区209例HLA-Ⅰ类抗体引起的血小板输注无效患者抗体特异性及epitopes分析

目的了解广州地区人类白细胞抗原(HLA)⁃Ⅰ类抗体所致血小板输注无效(PTR)患者的HLA抗体特异性及高频抗原决定簇。方法采用ELISA方法对209例PTR患者的HLA⁃Ⅰ类抗体进行检测。运用Luminex检测平台,通过HLA特异性抗体检测试剂盒(LIFECODES LSA^(TM)CLASS I)检测患者血清中针对HLA⁃A、B及Cw的特异性抗体;经MATCH IT!和HLA Matchmaker软件分析,获得患者HLA⁃Ⅰ类抗体特异性及相应epitopes。统计分析PTR患者血清中针对HLA⁃A、B、Cw位点的特异性抗体及epitopes的阳性频率。结果209份HLA⁃Ⅰ类抗体阳性PTR患者标本中共检出95种特异性抗体,其中针对HLA⁃A位点的抗体29种,以A*24:02(42.58%)最常见;检出针对HLA⁃B位点的抗体48种,阳性频率较高的有B*27:08(50.72%)、B*82:02(45.45%)、B*15:12(44.98%)、B*07:02(44.02%)、B*35:01(42.58%)、B*35:08(42.58%)和B*27:05(42.11%);针对血小板低表达Cw位点的抗体仅检出18种,常见C*07:01(19.62%)和C*07:02(18.66%)。运用HLA Matchmaker软件分析,共检出182种HLA⁃I类epitopes,以163 LG(19.28%)、71 KA(16.27%)、30 G(15.06%)、163 EW(11.45%)和127 K(11.45%)相对高频。结论获得广州地区PTR患者体内HLA⁃Ⅰ类抗体的分布特点,对血小板供者库的建立以及Eplet配型方法的开展提供理论依据。